曹嘉寧，孫文君，聶文惠

含載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌性能檢測

曹嘉寧1，孫文君2，聶文惠2

（1. 遼寧省實驗中學，遼寧 沈陽 110031； 2. 沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016）

實驗旨在對含載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌性能進行檢測。采用液體連續(xù)稀釋法和96孔板檢測法檢測載金屬離子沸石粉對細菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌）和真菌（白色念珠菌、黑根霉、黑曲霉）的最小抗菌濃度（MIC），以及平板菌落計數(shù)法對抗菌紙的抗菌率進行檢測（抗菌率計算公式為：5＝(-)/×100%，其中5為抗菌率，為對照平板菌落，為樣品平板菌落）。載金屬離子沸石粉對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分別達到1×10-7g/mL、1×10-5g/mL、1×10-6g/mL，對根霉和曲霉也具有一定的抑制效果?？咕垖Υ竽c埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抗菌率均在48%以上，完全符合《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》中所規(guī)定的抗菌率在26%以上的標準。

抗菌紙；載金屬離子沸石粉；抗菌性能

抗菌紙制品近幾年發(fā)展很快，受到人們的特別青睞。同時，抗菌紙制品還可以明顯地提高產(chǎn)品的附加值，使其發(fā)展迎來了新的機遇。但是由于抗菌紙制品的質(zhì)量與人體健康息息相關(guān)，因此其抗菌性的穩(wěn)定性尤為重要。本試驗即是基于以上背景，在《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》的基本要求之上增加了某些項目的檢測，以對此廠家提供的含載金屬離子抗菌紙的抗菌性能進行綜合檢測和評價，確保其產(chǎn)品質(zhì)量[6]，也為今后相關(guān)產(chǎn)品的研究者和研發(fā)企業(yè)提供一定的參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

所需儀器：凈化工作臺，搖床，恒溫培養(yǎng)箱，移液槍，96孔板，顯微鏡，血球計數(shù)板，接種環(huán)。實驗菌種包括大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，白色念球菌，黑根霉以及黑曲霉。各相應(yīng)的分析純級試劑（蒸餾水，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，葡萄糖，NaoH 等）。配制的培養(yǎng)基有完全培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基，液體沙氏培養(yǎng)基，固體沙氏培養(yǎng)基。配制溶液有磷酸鹽緩沖液（0.03 mol/L，pH 7.2）；NaOH溶液（0.2 mol/L）；Na2S2O3溶液（0.1 mol/L）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 菌種的活化及菌懸液制備

各保藏菌種分別接種至相應(yīng)新制備的斜面上（細菌使用固體完全培養(yǎng)基斜面，真菌使用固體沙氏培養(yǎng)基），放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細菌培養(yǎng)條件為37 ℃ 24 h，真菌培養(yǎng)條件28 ℃ 48 h），培養(yǎng)后用適量的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液（以下簡稱PBS）洗下菌苔，使菌懸浮均勻，再進行顯微鏡計數(shù)（用PBS稀釋）。最后按不同濃度將菌懸液分兩組（第一組用于平板菌落計數(shù)，濃度為1.4×105cfu/mL; 第二組用于MIC檢測，濃度為8×105cfu/mL）

1.2.2 中和劑鑒定試驗

根據(jù)《標準》所規(guī)定，在進行抗菌性能檢測前必須通過中和劑鑒定試驗。本試驗中金屬離子中和劑為硫代硫酸鈉溶液。

取8支無菌試管，分別按以下分組操作：

（1）染菌樣片（染菌的含有抗菌成分的樣片）＋5 mL PBS；

（2）染菌樣片＋5 mL中和劑；

（3）染菌對照片（染菌的不含有抗菌成分的樣片）＋ 中和劑；

（4）樣片（不染菌的含抗菌成分的樣片）＋5 mL中和劑＋染菌對照；

（5）染菌對照片＋5 mL PBS；

（6）同批次PBS；

（7）同批次中和劑；

（8）同批次培養(yǎng)基（固體完全培養(yǎng)基）。

以上各組同時放進搖床37 ℃ 300 r/min振搖1 h后同時取出，每組吸取0.5 mL涂布于無菌固體完全培養(yǎng)基平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

1.2.3 載金屬離子沸石粉MIC檢測方法

（1）載金屬離子沸石粉對大腸埃希菌E.coli的MIC檢測方法

制備400目、800目載金屬離子沸石粉無菌溶液，初始濃度為1×10-2g/mL，備用。取10支試管依次編號，往每只試管中加入4.5 mL CM。然后就往1號試管中加入0.5 mL備用的沸石粉，混勻后取0.5 mL 1號試管中溶液加入2號試管混勻。再取0.5 mL 2號試管中的溶液到3號試管混勻，以此類推到9號試管，9號試管最終棄去0.5 mL。10號試管中只有4.5 mL CM最為對照管。（400目和800目載金屬離子沸石粉MIC檢測操作方法相同）。

以上步驟完成之后，分別向每只試管中加入0.5 mL菌濃為8×105cfu/mL的大腸埃希菌懸液。將所有試管置于搖床37 ℃ 300 r/min振搖24 h后觀察菌濃變化。

（2）載金屬離子沸石粉對金黃色葡萄球菌S.aureus的MIC檢測方法

載金屬離子沸石粉對金黃色葡萄球菌的MIC檢測方法與對大腸埃希菌的MIC檢測方法相同。

（3）載金屬離子沸石粉對白色念珠菌M.albican的MIC檢測方法

載金屬離子沸石粉對白色念珠菌的MIC檢測方法中培養(yǎng)基為液體沙氏培養(yǎng)基，搖床振搖條件為28 ℃ 300 r/min振搖 ，其余操作與對大腸埃希菌的MIC檢測方法相同。

（4）載金屬離子沸石粉對黑根霉R.nigricans黑曲霉A.niger的MIC檢測方法

此步采用96孔板對載金屬離子沸石粉MIC進行檢測。

制備各溶液：⑴按1.28 g/mL濃度制備400目和800目無菌載金屬離子沸石粉標為A,B兩組。⑵制備400目載金屬離子沸石粉的抗菌紙（0.75 g于70 mL PBS中，37 ℃ 300 r/min按照時間1 h和2 h分為C，D兩組）。⑶制備800目載金屬離子沸石粉的抗菌紙（按上面400目的方法分為E，F(xiàn)兩組）。⑷同樣方法將無菌空白紙張組分為G，H兩組。對以上8組溶液進行96孔板的黑根霉和黑曲霉檢測。

1.2.4 含載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌性能檢測方法

（1）大腸埃希菌E.coli平板菌落計數(shù)試驗方法

稱取第一批含載金屬離子沸石粉抗菌紙和對照紙各0.75 g，剪成1.0 cm×1.0 cm大小碎片分裝包好，滅菌備用。按實驗需要分為3組，分別為樣品組，對照組以及空白組。每組的基本成分均為70 mL PBS＋0.5 mL 1.4×105cfu/mL 菌懸液，樣品組中另加入被試樣片，對照組加入對照樣片。

將上面所得的3組試劑及菌懸液依據(jù)在搖床中時間分別區(qū)分0 h、1 h、2 h、4 h。按照以0.5 mL/皿吸取上表各組溶液進行混菌平板涂布（培養(yǎng)基為CM）。所有平板均在37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

（2）金黃色葡萄球菌S.aureus平板菌落計數(shù)試驗方法

稱取第二批含400目和800目載金屬離子沸石粉抗菌紙和照樣片各0.75 g，剪成1.0 cm×1.0 cm大小碎片分裝包好，滅菌備用。按照上面大腸埃希菌一樣的方法分為含400目載金屬離子沸石粉抗菌紙和800目載金屬離子沸石粉抗菌紙兩個樣品組以及上面同樣的對照組和空白組。

同樣將上面所得的四組試劑及菌懸液依據(jù)在搖床中時間分別區(qū)分0 h、1 h、2 h。按照以0.5 mL/皿吸取上表各組溶液進行混菌平板涂布（培養(yǎng)基為CM）。所有平板均在37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。所有平板均在37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)。

（3）白色念珠菌M.albican平板菌落計數(shù)試驗方法

白色念珠菌平板菌落計數(shù)試驗方法中培養(yǎng)基為固體沙氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，其余操作與大腸埃希菌平板菌落計數(shù)試驗方法相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

對中和劑鑒定試驗中各組菌落進行計數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 菌落數(shù)統(tǒng)計表

根據(jù)《標準》評價規(guī)定：

（1）第1組無試驗菌，或僅有極少數(shù)試驗菌菌落生長；

（2）第2組有較第1組為多，但較第3、4、5組為少的試驗菌生長，并符合要求；

（3）第3、4、5組有相似量試驗菌生長，其組間菌落數(shù)誤差率不超過15％；

（4）第6-8組無菌生長。

所以中和劑鑒定試驗結(jié)果符合標準。

2.2 載金屬離子沸石粉MIC檢測結(jié)果

2.2.1 載金屬離子沸石粉對各菌的MIC檢測結(jié)果

表2 載金屬離子沸石粉對各菌的MIC檢測結(jié)果統(tǒng)計表

2.2.2 載金屬離子沸石粉對根霉曲霉的96孔板檢測結(jié)果

表3 載金屬離子沸石粉對根霉R.nigricans曲霉A.niger MIC檢測結(jié)果統(tǒng)計表 （g/mL）

2.3 含載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌性能檢測結(jié)果

2.3.1 大腸埃希菌平板菌落計數(shù)試驗結(jié)果

表4 大腸埃希菌E.coli平板菌落計數(shù)試驗結(jié)果統(tǒng)計表（cfu/皿）

對照組與空白組菌落數(shù)有相似的遞減規(guī)律，由此可以說明不含載金屬離子沸石粉的紙張對大腸埃希菌不具備抑制作用，因此可采用上述公式計算含載金屬離子沸石粉抗菌紙對大腸埃希菌的抗菌率，計算結(jié)果見表7。

2.3.2 金黃色葡萄球菌平板計數(shù)試驗結(jié)果

表5 金黃色葡萄球菌S.aureus平板計數(shù)試驗菌落數(shù)結(jié)果統(tǒng)計表 （cfu/皿）

對照組與空白組菌落數(shù)有相似的遞減規(guī)律，由此可以說明不含載金屬離子沸石粉的紙張對金黃色葡萄球菌不具備抑制作用，因此可采用上述公式計算含載金屬離子沸石粉抗菌紙對金黃色葡萄球菌的抗菌率，計算結(jié)果見表7。

2.3.3 白色念珠菌平板計數(shù)試驗結(jié)果

表6 白色念珠菌M.albican平板計數(shù)試驗結(jié)果菌落數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表 （cfu/皿）

對照組與空白組菌落數(shù)有相似的遞減規(guī)律，由此可以說明不含載金屬離子沸石粉的紙張對白色念珠菌不具備抑制作用，因此可采用上述公式計算含載金屬離子沸石粉抗菌紙對白色念珠菌的抗菌率，計算結(jié)果見表7。

表7 以上三個菌種的抗菌率計算結(jié)果統(tǒng)計表 ﹪

3 結(jié) 論

（1）載金屬離子沸石粉對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌都有顯著的抑制作用，其中800目載金屬離子沸石粉對大腸埃希菌的MIC高達1×10-8g/mL。試驗結(jié)果表明，無論400目還是800目載金屬離子沸石粉對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC都高于1×10-5g/mL，超過了日本同類產(chǎn)品8×10-4g/mL的標準。

（2）96孔板試驗結(jié)果說明載金屬離子沸石粉對黑根霉和黑曲霉也具有一定的抑制作用。因此可以得出結(jié)論：載金屬離子沸石粉具有廣譜抗菌性。

（3）含400目載金屬離子沸石粉抗菌紙與含800目載金屬離子沸石粉抗菌紙抗菌效果略有差別。含800目載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌率略高于含400目載金屬離子沸石粉抗菌紙的抗菌率。

（4）《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》規(guī)定：非溶出性抗菌產(chǎn)品抗菌率必須大于26％，產(chǎn)品才具有抗菌作用。本試驗中，含載金屬離子沸石粉抗菌紙對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抗菌率均在48%以上，最高可達85.87%。以上抗菌率統(tǒng)計結(jié)果可以證明含載金屬離子沸石粉抗菌紙張對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抗菌效果顯著，且完全符合《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》規(guī)定。

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Antibacterial Activity Testing of the Antibiotic Paper With Zeolite Powder Loaded With Metal Ions

1,2,2

（1.Liaoning Experimental High School,Liaoning Shenyang 110031, China ; 2. Shenyang Pharmaceutical University, Liaoning Shenyang 110016, China）

In order to detect the antibacterial activity of the antibiotic paper with zeolite powder loaded by metal ions,the liquid continous dilution method and 96-well plate testing method were used to detect the MIC of zeolite powder loaded with metal ions for bacteria() and fungus (). The method of plate culture count was applied to test antibacterial activity of antibiotic paper. (=(-)/×100﹪,x:antibacterial ratio,A:clump count of contrast,B:clump count of sample).The results show that, the MICs of zeolite powder loaded with metal ions for E.coli,S.aureus and M.albican are 1×10-7g/mL,1×10-5g/mL and 1×10-6g/mL,respectively. It also has a certain extent inhibiting effect on rhizopus and aspergillus.The antibacterial ratios of antibiotic paper forandall are above 48%.These data can match the criterion that antibacterial ratio must be upon 26% based on the sanitary standard of disposable hygienic products.

antibiotic paper ;zeolite powder loaded with metal ion;antibacterial activity

2016-10-20

曹嘉寧（1999-），女，遼寧省沈陽市人。

聶文惠（1991-），女，碩士學位，研究方向：微生物與生化藥學。

TQ 201

A

1004-0935（2017）01-0015-04