鐘文洲，林松挺，陳正義，黃曉曦

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)為腸道慢性非特異性炎癥疾病，其病變大多局限于結(jié)直腸黏膜及黏膜下層，病變部位多發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸，甚至包括整個結(jié)腸，然而臨床對其病因尚不明確，國外相關(guān)研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡對UC的免疫功能影響極大[1]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell leukemia/lymphoma-2, BCL-2)作為細(xì)胞凋亡抑制基因，其功能為抑制細(xì)胞正常凋亡。半乳糖凝集素3(Galectin-3, Gal-3)為糖粘合蛋白，其不僅與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附和遷移等細(xì)胞活動有關(guān)，還參與免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等生理和病理活動[2]。BCL-2和Gal-3在結(jié)構(gòu)上相似，本實驗探討兩者在UC患者結(jié)直腸黏膜組織中表達及與UC發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料選取海南省海口市人民醫(yī)院消化內(nèi)科2014年8月～2015年12月消化科住院部及門診確診為UC的患者64例，其中男性41例，女性23例，年齡23～78歲，平均(42.3±12.1)歲，設(shè)為觀察組。另選取健康志愿者50例作為對照組，其中男性31例，女性19例，年齡21～75歲，平均(41.1±11.7)歲。兩組患者年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)Riley分級[3]：Ⅰ級為黏膜充血，黏膜下血管網(wǎng)模糊并有淤血，Ⅱ級在Ⅰ級的基礎(chǔ)上充血更加明顯，并復(fù)加小潰瘍及黏膜顆粒，Ⅲ級在Ⅱ級的基礎(chǔ)上顆粒更為明顯，并添加自發(fā)性出血，小潰瘍?nèi)诤霞俺鲅撔詽B出物。觀察組中Ⅰ級28例，Ⅱ級21例，Ⅲ級15例。本實驗經(jīng)院倫理協(xié)會批準(zhǔn)，所有實驗患者均自愿簽署知情同意書。

1.2試劑與器械兔抗人Gal-3、BCL-2多克隆抗體(ABGENT公司，美國)，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch公司，美國)，恒溫箱(北京中儀萬成科技公司)。

1.3方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測BCL-2和Gal-3的表達，一抗為兔抗人Gal-3或BCL-2多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG(H+L)。將石蠟切片進行常規(guī)脫水及水化，第1次PBS沖洗后，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，通過高溫高壓修復(fù)抗原，第2次進行PBS沖洗。將兔抗人Gal-3 2 000倍稀釋或BCL-2多克隆抗體100倍稀釋，將一抗加入沖洗好的石蠟液內(nèi)，放進恒溫箱內(nèi)孵育2 h，第3次進行PBS沖洗，加入二抗，放進恒溫箱內(nèi)孵育30 min，第4次進行PBS沖洗，DAB顯色，第5次進行PBS沖洗，使用蘇木精進行復(fù)染，待返藍、脫水、烤干后封片。將PBS設(shè)置為一抗代替物作為陰性對照，設(shè)置空白對照組[4]。

1.3.2判斷標(biāo)準(zhǔn) 使用光鏡進行觀察，通過觀察染色程度進行陽性判斷，無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分[5]。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)明顯黃色顆粒為陽性。同時可通過顯微細(xì)胞計數(shù)檢測著色細(xì)胞比例：無陽性細(xì)胞為0分，1%～10%為1分，10%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：≥3分為陽性，<3分為陰性[6]。

2 結(jié)果

2.1UC和正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中BCL-2和Gal-3的表達Gal-3表達于結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，其在正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達水平較高，分布均勻，在UC結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達水平較低，且分布不均，呈斑點狀(圖1、2)。BCL-2表達于結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，其在正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達水平較低，表達主要區(qū)域為結(jié)腸隱窩基底部，在UC結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的表達水平較高，表達強烈的細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞(圖3、4)。對照組的Gal-3陽性率為100%，高于觀察組的37.5%(χ2=48.142，P<0.001)；對照組的BCL-2陽性率為20%，低于觀察組的90.62%(χ2=58.171，P<0.001，表1)。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎和正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中BCL-2和Gal-3表達[n(%)]

①②③④

圖1Gal-3在正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達，SP法
圖2Gal-3在潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達，SP法
圖3BCL-2在正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達，SP法
圖4BCL-2在潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達，SP法

2.2不同內(nèi)鏡分級UC患者BCL-2和Gal-3的表達水平UC Ⅰ級與Ⅱ級Gal-3陽性率的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.600，P=0.058)；UC Ⅰ級Gal-3陽性率高于UC Ⅲ級(χ2=4.532，P=0.033)；UC Ⅲ級與Ⅱ級Gal-3陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.183，P=0.669)；UC Ⅰ級BCL-2陽性率低于UC Ⅱ級(χ2=5.539，P=0.019)；UC Ⅰ級BCL-2陽性率低于UC Ⅲ級(χ2=6.098，P=0.014)；UC Ⅲ級與Ⅱ級BCL-2陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.511，P=0.475，表2)。

表2 不同內(nèi)鏡分級潰瘍性結(jié)腸炎的BCL-2和Gal-3陽性率比較[n(%)]

2.3BCL-2和Gal-3表達與UC患者臨床特征的關(guān)系BCL-2和Gal-3表達與UC患者性別、年齡及病程均無關(guān)(P>0.05，表3)。

表3 BCL-2和Gal-3表達與潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.4UC結(jié)直腸黏膜組織中BCL-2和Gal-3表達的相關(guān)性UC結(jié)直腸黏膜組織中BCL-2和Gal-3表達陽性者23例，占組內(nèi)35.94%，Person相關(guān)分析顯示，兩者表達無相關(guān)性(r=0.03，P>0.05)。

3 討論

UC臨床表現(xiàn)為腹部瘀結(jié)形成包塊，結(jié)直腸長期受到擠壓，本質(zhì)上為一種占位性病變[7]。結(jié)節(jié)的長期占位嚴(yán)重影響結(jié)直腸正常蠕動和血液供給，因此失去免疫能力，極易引發(fā)感染。結(jié)直腸被感染后出現(xiàn)腸黏膜充血，紋理模糊，形成結(jié)腸炎。由于長期不愈，腸絨毛糜爛潰瘍，形成板結(jié)性結(jié)節(jié)硬塊，從而引發(fā)全結(jié)腸潰瘍[8]。但目前對其發(fā)病因素尚未明確，BCL-2和Gal-3的結(jié)構(gòu)相似，且兩者均在結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達，所以本實驗通過探討兩者在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達水平，并探討兩者與UC發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。

本組實驗發(fā)現(xiàn)，UC結(jié)直腸黏膜組織中Gal-3陽性率高于正常黏膜組織；UC結(jié)直腸黏膜組織中BCL-2陽性率為低于正常黏膜組織。表明BCL-2和Gal-3在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達顯著異于正常結(jié)直腸黏膜組織。同時得出Gal-3在正常結(jié)直腸黏膜組織表達較為強烈，而在UC結(jié)直腸黏膜中的表達則顯著減弱。UC Ⅰ級Gal-3、BCL-2陽性率與UC Ⅱ級的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與UC Ⅲ級的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而UC Ⅱ級的Gal-3、BCL-2陽性率與UC Ⅲ級的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明Gal-3和BCL-2在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達受病變程度影響，且UCⅠ級Gal-3表達水平高，而在Ⅱ級和Ⅲ級表達水平較低。并且，BCL-2表達水平與Gal-3相反，隨著病變程度的加深而增高。既往文獻表明，BCL-2在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達增高為炎癥反應(yīng)的反應(yīng)性增生，推斷與隱窩上皮細(xì)胞再生修復(fù)有關(guān)[9]。此外，本組實驗發(fā)現(xiàn)，BCL-2和Gal-3的表達與患者性別、年齡及病程均無關(guān)，同時兩者在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達并無關(guān)聯(lián)性。結(jié)果進一步證明BCL-2和Gal-3表達只與病程相關(guān)，同時兩者間并無相互影響。然而國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，BCL-2和Gal-3在UC結(jié)直腸黏膜中的表達呈協(xié)同作用，兩者具備相關(guān)性[10]，與本文實驗結(jié)果不一致，日后應(yīng)進行更多實驗進行驗證。

Gal-3是一類糖粘合蛋白家族，具有多種生物學(xué)行為。Gal-3常以同二聚體的形式存在，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核和細(xì)胞表面也有表達[11]。外源性Gal-3可刺激成纖維細(xì)胞、腎小球細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長；內(nèi)源性Gal-3在細(xì)胞生長中起作用。通過轉(zhuǎn)染Gal-3反義寡核苷酸或者反義cDNA而使細(xì)胞系Gal-3表達受抑制[12]。既往研究表明，Gal-3存在抗凋亡作用，其表達水平增高有利于細(xì)胞抵抗由各種因素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并在凋亡刺激物的作用下,其能轉(zhuǎn)移到核周膜，且濃縮于線粒體內(nèi)，抑制細(xì)胞色素C釋放和防止線粒體遭受破壞[13]。此外Gal-3具備抗炎作用及介導(dǎo)細(xì)胞黏附作用[14]。BCL-2位于人體內(nèi)18號染色體，易位于14號染色體。BCL-2是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，能夠編碼BCL-2α和BCL-2β兩種蛋白質(zhì)，主要存在于線粒體外膜、核膜及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[15]。BCL-2可抑制細(xì)胞凋亡，從而延長細(xì)胞生存時間，正常結(jié)腸上皮組織發(fā)生凋亡的主要場所在隱窩和絨毛頂部，可通過清除衰老細(xì)胞，控制總體細(xì)胞數(shù)量，從而保持上皮組織的完整性。在炎性狀態(tài)下，細(xì)胞較正常情況下處于高激活狀態(tài)，更容易凋亡，故BCL-2在炎性組織中表達水平較高[16]。

潰瘍性結(jié)腸炎病因尚未明確，但臨床目前存在以下4個看法[17]：(1)感染學(xué)說：因本病的病理變化和臨床表現(xiàn)與細(xì)菌痢疾非常相似，相關(guān)研究從患者糞便中提取出細(xì)菌并發(fā)現(xiàn)可用抗生素治療；(2)免疫學(xué)說：認(rèn)為自身免疫介導(dǎo)的組織損傷是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的重要因素，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸壁病原體與人體結(jié)直腸上皮細(xì)胞存在交叉感染，從而引發(fā)機體免疫作用殺傷自身上皮細(xì)胞；(3)遺傳學(xué)說：國外數(shù)據(jù)表明白種人的UC發(fā)病率較黑種人顯著提高；(4)精神因素，認(rèn)為精神障礙引起自主神經(jīng)功能失調(diào)，導(dǎo)致腸壁炎癥及潰瘍形成。

綜上所述，BCL-2在UC結(jié)直腸黏膜組織中的表達水平高于正常結(jié)直腸黏膜組織，Gal-3表達水平低于正常結(jié)直腸黏膜組織，表達受UC內(nèi)鏡分級影響，但與患者性別、年齡及病程均無關(guān)。Gal-3和BCL-2在UC發(fā)病中可起到獨立作用。

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