李艷東，朱 琳，周永莉，周 伊，鄭建云

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌病死率位居惡性腫瘤的第2位[1]。由鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1, Orai1)和基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)為主要因子組成的鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)通道是鈣離子內(nèi)流的主要途徑，已經(jīng)被證明其參與許多腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移，包括胃癌[2]、鼻咽癌[3]、前列腺癌[4]等。有關(guān)結(jié)腸癌中Orai1和STIM1表達(dá)的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸腺癌中Orai1和STIM1蛋白的表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系，探討兩者表達(dá)與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2006年～2014年存檔的結(jié)腸腺癌石蠟標(biāo)本80例及正常結(jié)腸黏膜標(biāo)本50例。結(jié)腸腺癌病例根據(jù)《美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)癌癥分期手冊(cè)》(7版)相關(guān)組織學(xué)分型和臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷。兔抗人Orai1抗體、兔抗人STIM1抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2免疫組化將收集的蠟塊切片行免疫組化SP法檢測(cè)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定Orai1及STIM1蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色信號(hào)為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果判讀采用二級(jí)計(jì)分法：(1)按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：總分>4分為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，單因素生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Orai1在結(jié)腸腺癌及正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)Orai1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀物質(zhì)(圖1)。Orai1在結(jié)腸腺癌中的高表達(dá)率為68.8%(55/80)，在正常結(jié)腸黏膜中的高表達(dá)率僅為28.0%(14/50)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2STIM1在結(jié)腸腺癌及正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)STIM1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)亦定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀物質(zhì)(圖2)。STIM1在結(jié)腸腺癌中的高表達(dá)率為61.3%(49/80)，而在正常結(jié)腸黏膜中的高表達(dá)率僅為24.0%(12/50)，STIM1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸黏膜(P<0.05，表1)。

表1 Orai1和STIM1在結(jié)腸腺癌及正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)

①②

圖1Orai1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)，SP法圖2STIM1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)，SP法

2.3Orai1、STIM1表達(dá)與結(jié)腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系及兩者表達(dá)的相關(guān)性O(shè)rai1和STIM1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)均與TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡及分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，Orai1、STIM1蛋白在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P=0.001，rs=0.349，表3)。

表2 Orai1和STIM1表達(dá)與結(jié)腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)腸腺癌中Orai1和STIM1表達(dá)的相關(guān)性

2.4Orai1與STIM1表達(dá)與結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示，Orai1高表達(dá)組5年生存率(52.7%，29/55)明顯低于Orai1低表達(dá)組(76%，19/25)(Log-rank=4.633，P=0.031，圖3)。STIM1高表達(dá)組5年生存率(49%，24/49)明顯低于STIM1低表達(dá)組(77.4%，24/31)(Log-rank=7.833，P=0.005，圖4)。對(duì)Orai1表達(dá)(P=0.031)、STIM1表達(dá)(P=0.005)、患者年齡(P=0.89)、性別(P=0.751)、分化程度(P=0.184)、TNM分期(P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)進(jìn)行單因素生存分析顯示，Orai1表達(dá)、STIM1表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者生存率均有相關(guān)性。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素生存分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，Orai1及STIM1表達(dá)不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05，表4)。

圖3 Orai1表達(dá)與結(jié)腸腺癌患者生存率的關(guān)系

圖4 STIM1表達(dá)與結(jié)腸腺癌患者生存率的關(guān)系

預(yù)后因素BSEWalddfP值Exp(B)95.0%CI用于Exp(B)下限上限Orai1表達(dá)0.0430.5840.00510.9411.0440.3323.277STIM1表達(dá)0.0760.5740.01810.8951.0790.3503.323TNM分期2.6160.42238.4171<0.00113.6855.98331.301淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-1.7610.45115.2661<0.0010.1720.0710.416

3 討論

Orai1和STIM1是SOCE通道的核心蛋白，介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流，STIM1是STIM的亞型之一，STIM蛋白位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度的變化。Orai1是Orai的亞型之一，Orai蛋白位于細(xì)胞膜，能夠被STIM所激活。STIM1位于人染色體11p15.5，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為9.0×104，在人類正常組織中廣泛存在。Orai1為4次跨膜蛋白，位于人染色體12q24.31，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為3.8×104[5]。Orai1和STIM1介導(dǎo)的SOCE通道在腫瘤中能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管的生成，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲。研究顯示[6]，STIM1和Orai1介導(dǎo)的Ca2+通路在促進(jìn)惡性黑色素瘤的侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并提示Orai1主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞侵襲。Umemura等[7]的研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，通過(guò)敲除STIM1或者Orai1能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是SOCE介導(dǎo)的細(xì)胞功能通過(guò)CaMKII Raf-1/ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移需要與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，黏附斑的拆裝依靠Pyk2,這些均需要Ca2+激活發(fā)揮作用，SOCE通道通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，激活細(xì)胞膜上鈣通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)腫瘤侵襲[8]。

Orai1蛋白被證實(shí)在食管癌中過(guò)表達(dá)[9]，并且其表達(dá)與腫瘤分化及臨床分期相關(guān)，總生存期高表達(dá)者較低表達(dá)者短。Zhu等[10]研究結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤中，Orai1表達(dá)升高，下調(diào)Orai1能夠抑制SOCE通道從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制是調(diào)節(jié)Pyk2磷酸化。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Orai1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)高于正常結(jié)腸黏膜，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且Orai1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)與TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡及分化程度無(wú)關(guān)。Orai1高表達(dá)組5年生存率低于低表達(dá)組。研究結(jié)果提示Orai1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

對(duì)STIM1的研究顯示，STIM1在非小細(xì)胞肺癌[11]、胃癌[2]中過(guò)表達(dá)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STIM1在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸黏膜，這與Wong等[12]研究結(jié)果顯示STIM1在結(jié)腸癌中高表達(dá)結(jié)果一致。本組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示STIM1的高表達(dá)與結(jié)腸腺癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與患者預(yù)后相關(guān)，STIM1高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后更差。研究揭示STIM1與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是涉及多因素、多基因、多步驟的過(guò)程，許多基因被證明參與其中[13-14]。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Orai1蛋白與STIM1蛋白在結(jié)腸癌中均過(guò)表達(dá)，并且Orai1與STIM1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者表達(dá)均與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示Orai1與STIM1可能具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Xia等[2]研究認(rèn)為在胃癌中，Orai1和STIM1的高表達(dá)能夠上調(diào)MACC1的表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。STIM1參與了肝癌的發(fā)生，其與HIF-1相互作用促進(jìn)了肝癌的發(fā)展[15]。子宮頸癌中，STIM1過(guò)表達(dá)，對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及血管生成起重要作用[8]。胰腺癌細(xì)胞中，STIM1和Orai1過(guò)表達(dá)免于凋亡從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[16]。Orai1與STIM1蛋白在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探討。作為SOCE的關(guān)鍵分子，Orai1和STIM1可能是臨床治療結(jié)腸癌及預(yù)測(cè)預(yù)后的潛在新靶標(biāo)。

[1] Siegel R, Ma J, Zou Z,etal. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(1):9-29.

[2] Xia J, Wang H, Huang H,etal. Elevated Orai1 and STIM1 expressions upregulate MACC1 expression to promote tumor cell proliferation, metabolism, migration, and invasion in human gastric cancer[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):31-40.

[3] Zhang J, Wei J, Kanada M,etal. Inhibition of storeoperated Ca2+entry suppresses EGF-induced migration and eliminates extravasation from vasculature in nasopharyngeal carcinoma cell[J]. Cancer Lett, 2013,336(2):390-397.

[4] Holzmann C, Kilch T, Kappel S,etal. ICRAC controls the rapid androgen response in human primary prostate epithelial cells and is altered in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2013,4(11):2096-2107.

[5] Weilapierre L, Carrell E M, Boncompagni S,etal. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue[J]. Nat Commun, 2013,4:2805.

[6] Sun J, Lu F, He H,etal. STIM1-and Orai1-mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion[J]. J Cell Biol, 2014,207(4):535-548.

[7] Umemura M, Baljinnyam E, Feske S,etal. Store-operated Ca2+entry (SOCE) regulates melanoma proliferation and cell migration[J]. PLoS One, 2014,9(2):e89292.

[8] Chen Y F, Chiu W T, Chen Y T,etal. Calcium store sensor stromal-interaction molecule 1-dependent signaling plays an important role in cervical cancer growth, migration, and angiogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(37):15225-15230.

[9] Zhu H, Zhang H, Jin F,etal. Elevated Orai1 expression mediates tumor-promoting intracellular Ca2+oscillations in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2014,5(11):3455-3471.

[10] Zhu M, Chen L, Zhao P,etal. Store-operated Ca2+entry regulates glioma cell migration and invasion via modulation of Pyk2 phosphorylation[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2014,33:98.

[11] Li W, Zhang M, Xu L,etal. The apoptosis of non-small cell lung cancer induced by cisplatin through modulation of STIM1[J]. Exp Toxicol Pathol, 2013,65(7):1073-1081.

[12] Wong H S, Chang W C. Correlation of clinical features and genetic profles of stromal interaction molecule 1 (STIM1) in colorectal cancers[J]. Oncotarget, 2015,6(39):42169-42182.

[13] 張煒明, 宋國(guó)新, 平國(guó)強(qiáng), 等. 結(jié)腸癌組織中LKB1的表達(dá)及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016,32(10):1081-1083.

[14] 姜維娜, 黃維清, 劉 鑫, 等. 結(jié)腸癌組織中OTUB1的表達(dá)及其臨床意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(9):1009-1012.

[15] Li Y, Guo B, Xie Q,etal. STIM1 mediates hypoxia-driven hepatocarcinogenesis via interaction with HIF-1[J]. Cell Rep, 2015,12(3):388-395.

[16] Kondratska K, Kondratskyi A, Yassine M,etal. Orai1 and STIM1 mediate SOCE and contribute to apoptotic resistance of pancreatic adenocarcinoma[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1843(10):2263-2269.