劉 芳，王映梅,2，李明陽(yáng)，趙丹暉,2，李 俠,2，劉一雄，王 哲,2，閆慶國(guó),2

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種起源于成熟NK細(xì)胞和NK樣T細(xì)胞的侵襲性淋巴瘤，以瘤細(xì)胞顯著壞死、嗜血管分布和細(xì)胞毒性表型為特征[1]。該腫瘤的5年生存率在不同研究隊(duì)列中差異較大，總體預(yù)后不佳。因此，了解影響該腫瘤預(yù)后的分子機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)治療、預(yù)測(cè)預(yù)后、提高患者生存率有著重要的意義。研究表明，NF-κB信號(hào)通路對(duì)多種淋巴瘤的預(yù)后有顯著影響[2]，TNFAIP3基因編碼的A20蛋白是NF-κB信號(hào)通路全面的負(fù)性調(diào)節(jié)分子[3]。而TNFAIP3是否與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后有關(guān)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的組織炎細(xì)胞背景明顯，單純熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)在暗視野下不能區(qū)分炎細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，易造成結(jié)果偏差。聯(lián)合免疫熒光和熒光原位雜交(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasm, FICTION)法是一種將免疫熒光與熒光原位雜交結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，彌補(bǔ)FISH技術(shù)在暗視野下不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞的缺陷。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用FICTION技術(shù)檢測(cè)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中TNFAIP3基因的異常，探討TNFAIP3基因異常與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料收集2010～2015年第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院病理科診治的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例，選取腫瘤組織所占比例≥30%的109例納入本實(shí)驗(yàn)。收集患者臨床資料與組織蠟塊。

1.2FICTION檢測(cè)TNFAIP3基因紅色探針(BAC克隆號(hào)RP11-771C9和RP11-953L22，覆蓋該基因全部區(qū)段)及6號(hào)染色體著絲粒綠色探針由廣州安必平公司協(xié)助標(biāo)記。組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟；EDTA(pH 8.0)高壓抗原修復(fù)3 min；CD56抗體(Clone 56C04)孵育4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后TBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；避光孵育綠色熒光二抗45 min，TBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；在梯度乙醇溶液中洗滌脫水，空氣中晾干；TNFAIP3探針雜交，85 ℃變性5 min，37 ℃雜交20 h；37 ℃雜交洗液2×SSC洗滌2次，每次10 min，0.1%NP-40/2×SSC溶液洗滌1次，5 min；以DAPI進(jìn)行核復(fù)染；經(jīng)熒光顯微鏡成像及分析。分別統(tǒng)計(jì)每例CD56陽(yáng)性和陰性細(xì)胞中紅色信號(hào)數(shù)和綠色信號(hào)數(shù)，以紅色信號(hào)數(shù)少于綠色信號(hào)數(shù)的細(xì)胞為T(mén)NFAIP3缺失細(xì)胞，并計(jì)算每例中50個(gè)CD56陽(yáng)性和陰性細(xì)胞缺失細(xì)胞所占比例。以CD56陰性細(xì)胞為陰性對(duì)照，其缺失細(xì)胞的百分比值符合正態(tài)分布，以其均數(shù)加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差為判斷病例存在基因缺失的cutoff值，結(jié)果為42%，即CD56陽(yáng)性結(jié)果中缺失細(xì)胞所占比例>42%時(shí)，認(rèn)為此病例為T(mén)NFAIP3缺失。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD56陰性細(xì)胞中缺失細(xì)胞所占百分比值的正態(tài)性檢驗(yàn)采用矩法計(jì)算。TNFAIP3基因缺失與臨床病理特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特征腫瘤以瘤細(xì)胞顯著壞死、嗜血管分布為特征，所有病例EBER原位雜交檢測(cè)均呈陽(yáng)性(圖1)。109例結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中男性89例，女性20例；年齡范圍10～81歲(中位年齡42歲)；97例腫瘤原發(fā)于鼻部及其臨近結(jié)構(gòu)，7例原發(fā)于小腸，4例原發(fā)于扁桃體，1例原發(fā)于下肢。Ⅲ+Ⅳ期病例占26.0%(18/69)。42.3%(25/60)患者乳酸脫氫酶水平升高。根據(jù)國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果如下：低風(fēng)險(xiǎn)組48例(48/69，69.6%)，中低風(fēng)險(xiǎn)組17例(17/69，24.6%)，中高風(fēng)險(xiǎn)組3例(3/69，4.3%)，高風(fēng)險(xiǎn)組1例(1/71，1.4%)。因醫(yī)院病理庫(kù)中收錄的部分患者未在西京醫(yī)院治療，故患者Ann Arbor分期、B癥狀、IPI指數(shù)及血清乳酸脫氫酶水平指標(biāo)的收集不足109例。

AB

圖1結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的病理改變：A.瘤細(xì)胞壞死明顯，具有異型性；B.腫瘤細(xì)胞EBER原位雜交檢測(cè)陽(yáng)性

2.2結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中TNFAIP3基因缺失及其與臨床病理特征的關(guān)系在正常扁桃體組織進(jìn)行TNFAIP3探針檢測(cè)，細(xì)胞中綠色6號(hào)著絲粒染色體信號(hào)與紅色TNFAIP3信號(hào)比例相等(圖2A)，主要為細(xì)胞內(nèi)2紅/2綠信號(hào)，證明TNFAIP3探針研發(fā)成功。在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中行FICTION檢測(cè)，CD56抗體明確區(qū)分腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞(圖2B)。FICTION共成功檢測(cè)79例結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤，其中25例(25/79，32.1%)存在TNFAIP3基因缺失。TNFAIP3缺失與患者性別、年齡、B癥狀、腫瘤分期、乳酸脫氫酶水平無(wú)明星相關(guān)性(P均>0.05)，與IPI指數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(P=0.190，表1)。

AB

圖2TNFAIP3缺失檢測(cè)，紅色探針信號(hào)代表TNFAIP3基因，綠色探針信號(hào)代表6號(hào)染色體著絲粒，綠色細(xì)胞膜染色信號(hào)代表CD56陽(yáng)性：A.正常扁桃體，TNFAIP3基因正常，細(xì)胞為2紅/2綠信號(hào)；B.CD56細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞，TNFAIP3基因缺失，表現(xiàn)為1紅/2綠信號(hào)

表1 TNFAIP3基因缺失與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

3 討論

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種高度侵襲性腫瘤，在中國(guó)人群中發(fā)病率僅次于成熟B細(xì)胞淋巴瘤[4]。其臨床進(jìn)展快、遠(yuǎn)期預(yù)后差，并且目前無(wú)特效的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床。Yoon等[5]用放療結(jié)合MIDLE方案(甲氨蝶呤、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、地塞米松、L-天冬酰胺酶)化療法，患者3年生存率達(dá)81.5%。Michot等[6]應(yīng)用放療聯(lián)合ESHAP方案(依托泊苷、類(lèi)固醇、高劑量阿糖胞苷、鉑類(lèi))化療，使患者2年生存率達(dá)72%。但是2014年Kim等[7]的研究雖然加用了L-天冬酰胺酶的治療，患者5年生存率僅60%。Kwong等[8]報(bào)道87例亞洲NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的5年生存率為50%，并且作者強(qiáng)調(diào)IPI是影響患者預(yù)后與生存最重要的因素。Yu等[9]對(duì)115例中國(guó)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其5年生存率僅48.7%。對(duì)于患者的預(yù)后，不同的研究差異如此明顯，故了解影響該腫瘤預(yù)后的分子機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)治療、預(yù)測(cè)預(yù)后、提高患者生存率有著重要的意義。

研究表明，NF-κB信號(hào)通路對(duì)多種淋巴瘤的預(yù)后有顯著影響。NF-κB信號(hào)通路活化的外周T細(xì)胞淋巴瘤患者的生存時(shí)間長(zhǎng)于非活化組，并且NF-κB信號(hào)通路活化可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素，與總體生存顯著相關(guān)[10]。同時(shí)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的研究中也得出相同結(jié)論[11]。Chien等[12]在小鼠成瘤模型和細(xì)胞系中證實(shí)NF-κB信號(hào)通路活化可以促進(jìn)細(xì)胞衰老，提高腫瘤對(duì)化療的敏感性。

A20對(duì)NF-κB信號(hào)通路有全面抑制作用，但是TNFAIP3對(duì)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后是否有影響尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。A20蛋白具有泛素修飾酶的活性，可以去掉RIP1分子63位賴(lài)氨酸的多泛素化鏈，同時(shí)給48位賴(lài)氨酸加上一個(gè)多泛素化鏈，使得RIP1分子被蛋白酶體水解，從而不能活化IKK分子。IKK分子是NF-κB信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)分子，可以直接磷酸化與NF-κB分子結(jié)合的IκBα，使得IκBα被蛋白酶體降解，從而釋放NF-κB分子進(jìn)入核內(nèi)與DNA上特定位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用[13]。若無(wú)A20蛋白，RIP1分子便可以活化IKK分子，進(jìn)而使得NF-κB信號(hào)通路活化。TNFAIP3基因位于6q23-25，6q21-25是結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤最常發(fā)生缺失的區(qū)域[14]。然而針對(duì)TNFAIP3在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，32.1%(25/79)的病例存在TNFAIP3基因缺失，進(jìn)一步分析TNFAIP3基因缺失與患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TNFAIP3基因缺失與患者的IPI呈負(fù)相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNFAIP3基因缺失與患者Ann Arbor分期雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TNFAIP3基因缺失患者傾向于呈現(xiàn)較低分期，提示TNFAIP3基因缺失可能是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。研究應(yīng)用免疫熒光與熒光原位雜交結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)FICTION，以CD56抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，從而可以在暗視野下區(qū)分腫瘤細(xì)胞核與非腫瘤細(xì)胞核。這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)被廣泛運(yùn)用到淋巴瘤細(xì)胞及骨髓細(xì)胞的基因異常檢測(cè)中。Nomoto等[15]運(yùn)用FICTION技術(shù)成功在霍奇金淋巴瘤中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞的TNFAIP3缺失。Martinez-Ramirez等[16]針對(duì)FICTION技術(shù)的關(guān)鍵步驟-抗原修復(fù)，設(shè)置不同條件，探索出最佳修復(fù)時(shí)間和修復(fù)液酸堿度，同時(shí)作者認(rèn)為該技術(shù)在石蠟組織的腫瘤診斷，尤其是構(gòu)成復(fù)雜的腫瘤中存在巨大優(yōu)勢(shì)。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中存在高比例的TNFAIP3缺失，且TNFAIP3缺失與IPI指數(shù)顯著相關(guān)，提示TNFAIP3缺失是影響結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。對(duì)于NF-κB信號(hào)通路在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的活化情況，仍需深入研究，以進(jìn)一步闡明腫瘤預(yù)后的影響因素。

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