袁 芹

(連云港職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 連云港 222006)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是一類由黃曲霉、寄生曲霉菌等多種霉菌產(chǎn)生,是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生化合物,具有很強(qiáng)毒性，能嚴(yán)重破壞人和動物的肝臟組織，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致肝癌甚至死亡。世界上大多數(shù)國家和地區(qū)都規(guī)定其在食品中限量要求，并要求對黃曲霉毒素進(jìn)行有效監(jiān)管[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素及其衍生物有20余種，天然產(chǎn)生的黃曲霉毒素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同分為B1、B2、G1、G2四種(結(jié)構(gòu)式見圖1)。其中以AFB1的毒性最大。

食品中黃曲霉毒素的檢測方法常見的有超臨界流體萃取技術(shù)、加壓流體萃取技術(shù)、固相萃取技術(shù)、免疫親和層析技術(shù)等[2]。分散固相萃取法(dSPE)是近十年發(fā)展起來的新型樣品前處理方法, 將凈化吸附材料直接分散于待凈化的提取液中, 吸附基質(zhì)中的干擾成分,集萃取和凈化于一身,具有操作簡便高效、溶劑用量少、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn), 是一種綠色環(huán)保的樣品前處理方法[3]。

碳納米管(CNTs)與傳統(tǒng)材料相比，具有比表面積大、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性能強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來已被用于吸附材料[4-5]。但CNTs的水不溶性等理化性質(zhì)又限制其應(yīng)用。通過對CNTs修飾、改性以提高其性能。改性后CNTs管，由于其微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使CNTs管具有更優(yōu)異的吸附特性[6]。我們前期的研究表明，碳納米管經(jīng)海藻酸鈉改性后具有良好的分散性能和吸附性能[7,8]。目前對于利用改性碳納米管作為dSPE凈化吸附材料, 結(jié)合HPLC同時(shí)檢測大米中4種黃曲霉毒素的相關(guān)報(bào)道較少。

本文采用自制的改性碳納米管作為dSPE凈化吸附材料，結(jié)合HPLC同時(shí)測定大米中的4種黃曲霉毒素，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)，建立的方法靈敏度高，為納米技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖1 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of AFT

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20 AT HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器(日本島津公司)；BL6-180型高功率數(shù)控超聲波清洗器(上海比朗儀器有限公司)；MS3 minishaker旋禍混勻器(IKA公司,德國)。

SAL-MWCNT-COOH(連云港職業(yè)技術(shù)學(xué)院自制)；AFB1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 公司,美國);甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子蒸餾水，其他試劑均為分析純。

大米樣品:購于江蘇省連云港市市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量AFB1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100 mg/L的單標(biāo)儲備液，吸取適量單標(biāo)儲備液用乙腈稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。以內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3 樣品前處理

稱取適量大米樣品磨碎，備用。稱取5 g磨碎的大米樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入100 μg/L內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，然后加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)，渦旋混勻1 min，置超聲波清洗器中超聲提取10 min，再以5 000 r/min離心5 min，收集上清液至另一50 mL聚丙烯塑料離心管中。用純凈水稀釋上清液至40 mL，混勻后取其中20 mL，加入適量SAL-MWCNTS-COOH，中速振蕩提取2 min，以10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，殘余物中加入適量的乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，以10 000 r/min離心2 min，上清液于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑靡译?水(50∶50， v/v)溶解殘余物，渦旋1 min后以8 000 r/min離心3 min，吸取上清液過0.22μm濾膜后供HPLC分析。

1.4 HPLC條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈和水；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積20 μL；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫程序：0～7 min。

乙腈60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，7～30 min乙腈60%線性升至90%；檢測波長365 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 dSPE條件的優(yōu)化

2.1.1提取液濃度的優(yōu)化

目前，黃曲霉毒素的提取方法主要以甲醇—水、乙腈—水為提取劑液。本文在參考文獻(xiàn)[9～12]的基礎(chǔ)上，選擇乙腈—水作為提取液，比較了60、75、80、85、90%乙腈—水的提取效率，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)采用80%乙腈—水溶液對4種黃曲霉毒素提取效果總體最佳，均迗到93.5%以上的回收率，故選擇80%乙腈—水溶液作為提取溶液。

2.1.2提取液pH值的影響

添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(10 000 μg/L) 400 μL于20 mL空白大米樣品提取液中，加水稀釋至40 mL， SAL-MWCNT-COOH用量為200 mg，調(diào)節(jié)pH 值為3-10，T=25 ℃ ，按1.3所述進(jìn)行操作，來考察提取液pH值對回收率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知， 4種黃曲霉毒素的吸附率在提取液pH值為7時(shí)回收率最大。這是由于黃曲霉毒素在中性溶液中較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的強(qiáng)堿溶液中，其內(nèi)酯環(huán)開裂分解迅速，導(dǎo)致待測物與SAL-MWCNT-COOH吸附效率大大下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇提取液的pH值為7進(jìn)行dSPE研究。

圖2 提取液pH對回收率的影響Fig 2 Effect of pH on recovery

2.1.3SAL-MWCNT-COOH用量的影響

在提取液pH值為7，T=25 ℃ 條件下，SAL-MWCNT-COOH復(fù)合物對大米中黃曲霉毒素的回收率隨其投加量的變化見圖3。

圖3 SAL-MWCNT-COOH用量對回收率的影響Fig 3 Effect of SAL-MWCNT-COOH on recovery

由圖3可知，當(dāng)SAL-MWCNT-COOH復(fù)合物的投加量在25～200 mg范圍內(nèi)時(shí)，吸附率隨其投加量增大而急劇增加，這是由于吸附劑的量增多，增加了有效官能團(tuán)和吸附的活性位點(diǎn)，當(dāng)SAL-MWCNT-COOH復(fù)合物投加量為125 mg時(shí)，四種黃曲霉毒素的平均回收率達(dá)到92.5%，繼續(xù)增大投加量，回收率變化不大。所以從經(jīng)濟(jì)角度考慮，并不是吸附劑量越大越好。

2.1.4洗脫液的選擇

考慮到黃曲霉毒素的脂溶性，在上述優(yōu)化后的最佳條件下進(jìn)行洗脫劑選擇試驗(yàn)，考察了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯作洗脫劑時(shí)大米中四種黃曲霉毒素的回收率較高(圖4)，故選擇用乙酸乙酯作洗脫劑。

對乙酸乙酯進(jìn)行體積優(yōu)化，洗脫溶劑體積對回收率的影響見表1。從表1可看出，隨著洗脫體積增多，四種黃曲霉毒素的洗脫回收率增大，當(dāng)洗脫液體積為25 mL時(shí)，四種黃曲霉毒素未能被完全洗脫；當(dāng)洗脫體積大于25 mL時(shí)，四種黃曲霉毒素的洗脫回收率變化不大，故本實(shí)驗(yàn)宜選擇25 mL乙酸乙酯作為洗脫劑。

圖4 不同洗脫液對回收率的影響Fig 4 Effect ofdifferent eluent on recovery

AF名稱回收率/(%)5mL10mL15mL20mL25mL30mL35mLAFB175．3584．1386．7494．1496．5097．4598．13AFB270．1375．4482．4589．1792．0292．2393．57AFG169．2675．4780．3288．3691．6392．6692．66AFG257．9166．5972．3481．0590．1591．0191．23

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1檢測波長

用紫外檢測器對分離后的4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)儀器對不同黃曲霉毒素的響應(yīng)信號強(qiáng)弱，實(shí)際大米樣品中黃曲霉毒素殘留的含量以及基線平穩(wěn)狀況，確定了檢測波長為365 nm。

2.2.2流動相及流速

考察了甲醇一水和乙腈一水作為流動相的相對情況。結(jié)果表明，當(dāng)以甲醇--水為流動相時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，色譜出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；以乙腈—水為流動相時(shí)，基線穩(wěn)定且4種黃曲霉毒素分離度能達(dá)到分析要求。在乙腈--水作為流動相的基礎(chǔ)上考察了流速為0.4、0.6、0.8、1．0 mL/min時(shí)對4種黃曲霉毒素分離度的影響。當(dāng)流速為0.6mL/min時(shí)，效果最好，故流速選擇為0.6 mL/min。

2.3 方法的線性和檢出限

將現(xiàn)有的4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、 1.0、 5.0、10.0、 20.0、 40.0、100.0、200.0μg/L9個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件進(jìn)行測定，以標(biāo)液的質(zhì)量濃度(X，mg/L)與峰面積(y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線的回歸方程如表2所示，在0.2～200.0 μg/L線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。以1.0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，按3倍信噪比計(jì)算，4種黃曲霉毒素的檢出限為0.043、0.031、0.028、0.018μg/L；以10倍信噪比計(jì)算，其定量下限為0.142、0.103、0.090 2、0/073 μg/L。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及方法的檢出限Table 2 Linear ranges ,linear equation ,correlation coefficient(r) and limits of the method

2.4 方法的精密度和準(zhǔn)確度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,對大米樣品中4種黃曲霉毒素進(jìn)行添加回收率試驗(yàn),加標(biāo)濃度為0.2～200.0 μg/kg，每個(gè)濃度平行進(jìn)行6個(gè)水平分析，結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率分別為84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)位5.8～9.2%(見表3)。

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用該方法對市售的新大米檢測，均未查出4種黃曲霉毒素。

表3 添加回收率Table 3 The recoveries and precisions of aflatoxin Bl，B2，G1and G2 in spiked samples(n=6)

3結(jié) 論

本文采用自制的改性碳納米管作為dSPE填料用于大米中黃曲霉毒素的dSPE- HPLC檢測，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，在 0.2～200.0μg /L線性范圍內(nèi)，所得4種黃曲霉毒素的回歸方程均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9987～0.9998, 檢出限為0.043、0.031、0.028、0.018 μg/L，定量下限為0.142、0.103、0.0902、0/073 μg/L；加標(biāo)回收率分別為84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)為5.8～9.2%，可滿足痕量分析的要求。

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