張勁藹+黃華枝+畢可可+孫龍華

摘要：褐根病是由有害木層孔菌引起的林木和多年生果樹的重要根部病害。通過綜述了近年來有關(guān)褐根病菌的單克隆抗體檢測(cè)法等4種分子檢測(cè)技術(shù)和生防放線菌等4種生物防治的研究，指出由于分子檢測(cè)方法的敏感度和特異度高，可用于早期診斷褐根病菌；同時(shí)也表明用生物防治替代傳統(tǒng)的化學(xué)防治進(jìn)行褐根病菌防治，并使生物制劑有效推廣運(yùn)用，將是今后研究的熱點(diǎn)和控制該病害的主要手段。

關(guān)鍵詞：褐根病菌；分子檢測(cè)；生物防治

文章編號(hào)：1671-2641（2016）06-0000-00

中圖分類號(hào)：S763.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract： Brown root rot disease， caused by Phellinus noxius， has become an important disease of forest and perennial fruit trees. This paper summarizes 4 kinds of molecular detections such as monoclonal antibody detection and 4 kinds of biological control such as actinomyces of brown root rot disease. It points out that molecular detection will be feasibly early diagnostic tool for brown root rot disease due to its high sensitivity and specificity. And it shows that it will be focus of biological control instead of the traditional chemical methods to control brown root rot disease and major measures of application of biological control preparation effectively in the future.

Key words： Phellinus noxius； Molecular detection； Biological control

褐根病是由有害木層孔菌Phellinus noxius （Corner） Cunningham引起經(jīng)濟(jì)作物、果樹、古樹名木和園林綠化植物等毀滅性破壞的土傳病害。染病樹木因根部腐朽造成生長(zhǎng)衰弱、樹葉變黃、枯萎脫落，樹木的根部表皮呈紅褐色，受害面積逐漸增大，然后木質(zhì)變白、疏松軟化，具蜂窩狀褐色紋線，粘有土壤和褐色菌絲體，使樹皮變得粗糙[1-2]。從黃化到枯死通常只需一至三個(gè)月，大些的植株或根系較深廣的植株從發(fā)病到死亡可能需要數(shù)年的時(shí)間。該病最早于1928年由澤田兼吉在臺(tái)灣的樟樹Cinnamomum camphora、龍眼Dimocarpus longan、月橘M(fèi)urraya paniculata等樹木的根部發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被鑒定為橡膠層孔菌Fomes lamaensis，直到1965年Cunningham才將其歸類為有害木層孔菌[2]。褐根病菌主要分布在亞洲、澳洲、美國和非洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)[3]。目前，褐根病菌是中國臺(tái)灣、中國香港和澳門、日本、澳洲和馬來西亞等地區(qū)木本植物根部的主要病原菌之一，有“林木殺手”或“樹癌”之稱[4]。

有害木層孔菌屬于擔(dān)子菌門，層菌綱，非褶菌目，銹革孔菌科，木層孔菌屬，生長(zhǎng)最適溫度30℃，8℃以下不生長(zhǎng)。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落初期白色至草黃色，后變成湖泊褐色至暗褐色，產(chǎn)生特征性不規(guī)則暗褐色紋線或凹陷，形成節(jié)孢子和毛狀菌絲。在自然條件下極少形成擔(dān)子果[2]。該病原菌寄主范圍十分廣泛，可為害超過59科200種植物，它是中國大陸的檢疫性有害生物之一[5]，因此加強(qiáng)進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫措施，防止病害進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延的意義重大。目前主要采取砍除病樹、掘溝阻斷病原傳播、熏蒸處理病土和種植無病苗木等防控措施，但是尚未有一種理想的防治藥劑和防治方法能有效地控制樹木褐根病的發(fā)生[4]。另外，雖根據(jù)前期的研究結(jié)果表明一些化學(xué)藥劑能有效地抑制這種病菌[6]，但化學(xué)藥劑往往容易造成環(huán)境污染，危害人的健康，因此開發(fā)環(huán)境友好型和防效高的藥劑在城市園林樹木保護(hù)中具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。而生物防治方法因其低毒、無污染越來越受到關(guān)注和重視，并極大豐富了褐根病的防治研究。本文綜述了近年來有關(guān)褐根病菌的分子檢測(cè)技術(shù)和生物防治的研究，以期為后續(xù)開展褐根病的檢測(cè)和生物防治工作提供參考。

1 褐根病菌的分子檢測(cè)研究

目前褐根病菌的檢測(cè)以病癥識(shí)別及組織分離病原菌為主，但這類傳統(tǒng)方法往往耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低及專業(yè)性強(qiáng)，難以達(dá)到快速診斷和檢測(cè)的目的[7]。而利用分子生物學(xué)技術(shù)來診斷病害能在植株出現(xiàn)病癥前檢測(cè)到病原菌，實(shí)現(xiàn)快速、正確診斷，因此對(duì)病害的防治有至關(guān)重要的作用[8]。

1.1 單克隆抗體檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）是一種酶免疫分析方法，最早在1971年由Engvall和Perlman提出，隨后經(jīng)過了不斷改進(jìn)和提高[9]。ELISA的原理是通過抗體和抗原的特異反應(yīng)結(jié)合底物與酶的顏色反應(yīng)來判斷結(jié)果，具有特異性強(qiáng)、符合率高、敏感性高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在食品微生物、毒素、動(dòng)物傳染病以及植物病原細(xì)菌、真菌和病毒等的檢測(cè)中[9]。2010年，吳孟玲等[10]應(yīng)用雜交瘤（Hybridoma）技術(shù)，開發(fā)出專門針對(duì)褐根病菌的單克隆抗體，并結(jié)合ELISA方法建立了褐根病快速診斷方法，僅需要0.5 g根部組織即可檢測(cè)褐根病菌感染；該雜交瘤細(xì)胞株具有對(duì)褐根病菌反應(yīng)高而對(duì)健康植物組織與其他相似真菌Ganoderma sp.和P. gilvus反應(yīng)低的特異性。

1.2 基因芯片檢測(cè)法

基因芯片是利用光導(dǎo)原位合成或者微量點(diǎn)樣等方法，把大量的DNA探針如基因、PCR產(chǎn)物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在載體表面，與標(biāo)記的核酸樣品雜交后，能快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模地獲取樣品核酸序列信息。目前國內(nèi)外利用寡核苷酸芯片對(duì)病毒、細(xì)菌和真菌等進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的研究廣泛，并在對(duì)其病原體檢測(cè)、種類鑒定、功能基因檢測(cè)、基因分型、突變檢測(cè)、基因組監(jiān)測(cè)等方面獲得了成功[11]。2016年，Tzean等[12]利用基因芯片方法在褐根病菌的rDNA-ITS區(qū)設(shè)計(jì)探針，可精確鑒定和診斷17種木層孔菌屬病原菌，其中包括有害木層孔菌；他們發(fā)現(xiàn)在PVC膜上可檢測(cè)低至1 pg的褐根病菌DNA樣品?；蛐酒z測(cè)有害木層孔菌的靈敏性、準(zhǔn)確度高，耗時(shí)短，應(yīng)用前景良好。

1.3 ITS特異擴(kuò)增檢測(cè)法

相對(duì)于傳統(tǒng)的生物學(xué)檢測(cè)，PCR檢測(cè)技術(shù)具有高敏感性、高特異性等特點(diǎn)，故成為非常重要的病原菌檢測(cè)方法[13]。目前，利用16SrDNA序列設(shè)計(jì)特異引物檢測(cè)細(xì)菌微生物種類的應(yīng)用非常廣泛[14]。在真菌中，rDNA編碼序列由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄區(qū)包括5S、5.8S、18S、28S rDNA，非轉(zhuǎn)錄區(qū)是18S和5.8S之間以及5.8S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS。18S、5.8S、28S rDNA基因序列進(jìn)化較緩慢且相對(duì)保守，ITS區(qū)的進(jìn)化則相對(duì)較快，因此可根據(jù)它們的序列信息進(jìn)行鑒定。2007年，蔡志濃等[7]首次在褐根病菌ITS區(qū)設(shè)計(jì)具有高度特異性及靈敏度的引物對(duì)PN-1F/PN-2R，得到一條約420 bp的特異片段，在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確、靈敏地診斷出臺(tái)灣褐根病菌。相似地，吳孟玲等[15]先以通用性引物對(duì)ITS1-F/ITS-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過測(cè)序與比對(duì)后再重新設(shè)計(jì)出針對(duì)褐根病菌的特異性引物對(duì)G1F/G1R，擴(kuò)增得到一條653 bp的特異片段；并通過優(yōu)化DNA的提取方法，可針對(duì)極少量的樣本進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)10 pg。2016年梁艷瓊等[7]利用引物對(duì)G1F/G1R，分析了橡膠上不同病原物的擴(kuò)增特異性，發(fā)現(xiàn)對(duì)橡膠樹紅根病菌、紫根病菌、臭根病菌、白根病菌和清水對(duì)照均無擴(kuò)增條帶，只有橡膠樹褐根病菌才能擴(kuò)增成功，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了該引物對(duì)的特異性。最近，Wang等[16]利用引物對(duì)G1F/G1R結(jié)合普通PCR進(jìn)行分析得出，在檢測(cè)的香港38個(gè)可疑樹種中有13種感染了褐根病菌。但結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）檢測(cè)時(shí)，那些原來使用普通PCR方法未檢測(cè)到的土壤中也能檢測(cè)到褐根病菌，這說明褐根病菌可能廣泛存在香港的土壤中。

1.4 等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

2000年，Notomi等[17]所開發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification， LAMP）是一種全新且快速靈敏的檢測(cè)方法。，LAMP利用能識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下即能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，故對(duì)儀器的要求不高，恒溫水浴鍋即可。此外，結(jié)果可用濁度計(jì)檢測(cè)或者在反應(yīng)液中添加熒光染料后直接肉眼觀察，全反應(yīng)過程不到1小時(shí)，可在短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)相比，LAMP技術(shù)更簡(jiǎn)單、快速，而且具有更高的特異性、敏感性和有效性[17]。目前，LAMP技術(shù)已被廣泛用于臨床診斷、食品安全性檢測(cè)和重要病原菌種類鑒定。2014年，黃裕星等[18]利用褐根病菌特異的ITS區(qū)域設(shè)計(jì)出三組LAMP引物，并對(duì)來自Phellinus屬的9種不同供試菌進(jìn)行LAMP分析，最終確定了一組能特異檢測(cè)出植物褐根病菌的最佳引物。研究結(jié)果表明，在同等DNA模板條件下，其靈敏度較普通PCR檢測(cè)法提升10倍。因此該方法有望成為一種新的褐根病分子診斷法被廣泛應(yīng)用。

2 褐根病菌的生物防治研究

生物防治是利用有益生物或其他生物來抑制或消滅有害生物的一種防治方法，通過植物、病原菌、拮抗菌、植物表面及周圍微生物群落和自然環(huán)境等因素之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)促生防病。目前研究的生防微生物種類包括放線菌、木霉菌、芽孢桿菌等幾大類。

2.1 生防放線菌

放線菌是呈纖維狀的革蘭氏陽性細(xì)菌，與真菌相似但沒有細(xì)胞核。放線菌種類豐富，廣泛存在于土壤和植物根際等環(huán)境，代謝功能各異，是實(shí)際用途廣泛的微生物資源。用于植物生物防治的主要是鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）及其相關(guān)的類群[19]。Kothandaraman等[20]發(fā)現(xiàn)土壤根際的放線菌可以抑制褐根病，但并未作進(jìn)一步防治應(yīng)用研究。2012年，Yanti等[21]從土壤中分離出三種能重寄生于有害木層孔菌的放線菌，分別命名為KT2F、MG01和MG02，其中KT2F能有效抑制有害木層孔菌，推測(cè)可作進(jìn)一步深入研究。

2.2 生防木霉菌

木霉菌（Trichoderma）作為生防真菌的研究已有大量的報(bào)道[22]。木霉菌屬于真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科，是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分；其適應(yīng)性、腐生性強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面，作為生防微生物具有存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點(diǎn)。有報(bào)道稱，木霉菌能成功防治真菌性、細(xì)菌性和病毒性等病害，國外已有多種相關(guān)商品問世。目前生防木霉菌主要應(yīng)用在防治土傳病害[22]。2010年，倪蕙芳等[23]利用玻璃紙對(duì)峙法，從土壤中篩選出2株對(duì)褐根病菌菌絲生長(zhǎng)具有100%抑制效果的木霉菌菌株，分別為Tri-003和Tri-080，其生長(zhǎng)速度快且產(chǎn)孢能力極佳，三天即可長(zhǎng)滿直徑9 cm的PDA平板，具有病害防治潛力，可進(jìn)一步將其開發(fā)為生防制劑。另有研究表明，有害木層孔菌的生物防治主要受木霉菌的種類、寄主植物的類型和環(huán)境條件（溫度和水分含量）等因素的影響。在實(shí)驗(yàn)室條件下，木霉菌屬能有效阻止有害木層孔菌菌株的生長(zhǎng)，降低因有害木層孔菌侵染所致木材腐爛比率，但結(jié)果仍需進(jìn)一步的大田實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[24]。2015年，李和平等[25]通過平板對(duì)峙法測(cè)定9個(gè)木霉菌菌株對(duì)橡膠樹褐根病菌的拮抗作用，有3株對(duì)橡膠樹褐根病病原菌的拮抗作用顯著，其中2株在第8 d對(duì)褐根病病原菌的抑制率仍能達(dá)到100%。

2.3 生防芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動(dòng)植物的體表，自身沒有致病性，可分泌多種酶和抗生素，殺滅一些常見的病原菌，用途十分廣泛?？莶菅挎邨U菌是最具開發(fā)潛力的生物殺菌劑，可產(chǎn)生40多種不同結(jié)構(gòu)的抗菌物質(zhì)[26]。2011年，趙璐璐等[27]從橡膠樹根部分離出1株枯草芽孢桿菌Czk1，對(duì)引起橡膠樹褐根病的致病真菌及其他病原真菌均具有拮抗作用；研究發(fā)現(xiàn)該菌株轉(zhuǎn)接20代后抑菌活性仍非常穩(wěn)定，持效期長(zhǎng)，具有較高的潛在生防利用價(jià)值。

2.4 其他生防菌和有益微生物

土壤是一個(gè)多種微生物共生的場(chǎng)所，故選擇能夠共生、具拮抗褐根病作用的菌株共同防治褐根病效果更佳。2009年，Chakraborty等[28]從茶樹根際分離出人蒼白桿菌TRS-2，對(duì)包括有害木層孔菌在內(nèi)的6種供試病原菌均具有抑制性。此外，人蒼白桿菌懸浮液施于根周圍還能促進(jìn)茶樹的生長(zhǎng)。2012年，佘俊弘[29]研究發(fā)現(xiàn)從山林采集的土壤中分離純化出的野生混合菌及篩選出的單株純種放線菌均能抑制褐根病菌，野生混合菌的抑制效果優(yōu)于單株純種放線菌。2014年，吳孟玲等[30]通過不同混合比例的多株拮抗微生物菌，進(jìn)行抑菌效果測(cè)試，結(jié)果顯示混合生物制劑可應(yīng)用在褐根病的預(yù)防，能有效降低褐根病大量發(fā)生的概率。2016年，畢可可等[31]從澳門松山市政公園健康樹木的根際分離得到1株對(duì)褐根病菌具有較強(qiáng)拮抗活性的伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.），為進(jìn)一步研究其生防作用打下了基礎(chǔ)。

3 展 望

褐根病的致病菌為有害木層孔菌，寄主范圍非常廣，是熱帶和亞熱帶地區(qū)引起果樹、木本觀賞植物以及林木立枯的最重要病害，造成果園和森林植株大量死亡，而且病害呈蔓延趨勢(shì)。目前尚未有一種有效防治藥劑或方法控制該病害。其中重要的原因是褐根病發(fā)生早期不易被發(fā)現(xiàn)，待其出現(xiàn)癥狀時(shí)，病菌危害已十分嚴(yán)重，加大了防治難度。故當(dāng)前應(yīng)加強(qiáng)檢疫管理，樹木栽種前要做好病害檢疫，培育健康種苗，從根源阻絕發(fā)病地區(qū)的植株，銷毀病根，熏蒸消毒病土，盡可能切斷病菌傳播途徑。能提早診斷褐根病并采取相應(yīng)防治措施對(duì)其病害治理意義非凡。分子檢測(cè)最主要的優(yōu)點(diǎn)是僅用少量病原菌DNA即可檢測(cè)出結(jié)果，尤其適合褐根病這種早期不容易察覺的病害檢測(cè)，因而應(yīng)用前景廣泛。本文著重介紹了4種各有千秋的褐根病菌分子檢測(cè)技術(shù)，但仍需在生產(chǎn)實(shí)踐中結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法作進(jìn)一步檢驗(yàn)。最近Wang等[16]利用靈敏度高的qRT-PCR技術(shù)在未現(xiàn)癥狀的樹木土壤中都檢測(cè)出褐根病菌，此法或能發(fā)揮今后有效控制褐根病傳播和蔓延的重要指導(dǎo)作用。

褐根病的防治以物理和化學(xué)方法為主，譬如用外科手術(shù)方式把感染組織切除再用藥劑處理傷口，或通過浸水一個(gè)月殺死有害木層孔菌等[32]，但都僅限于病狀早期診斷發(fā)現(xiàn)的病株。到目前為止尚未出現(xiàn)專門的褐根病殺菌劑，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，且污染環(huán)境，因此國內(nèi)外更關(guān)注高效低毒、無污染的防治方法[4， 33-34]。目前生物防治以其無公害等特點(diǎn)備受關(guān)注。此外，已有大量關(guān)于生物防治用于防治其他重要植物病原真菌、細(xì)菌和病毒等病害的研究報(bào)道[22]，也有多種相關(guān)商品問世，但關(guān)于樹木褐根病的生物防治研究則處于起步階段。目前針對(duì)褐根病菌的生防微生物研究工作主要集中在其分離、篩選和室內(nèi)盆栽的防治試驗(yàn)，但褐根病菌的生防微生物種質(zhì)資源還有待進(jìn)一步挖掘并豐富其多樣性；此外，大田應(yīng)用的環(huán)境條件遠(yuǎn)比室內(nèi)試驗(yàn)復(fù)雜，所以關(guān)于褐根病的生物防治仍需進(jìn)行大量的研究工作。值得欣慰的是生物防治作為一項(xiàng)無污染防治法在今后防控褐根病的方法中占比會(huì)越來越大。

致謝：本文資料收集過程中得到澳門民政總署管理委員會(huì)梁冠峰委員、原園林綠化部潘永華部長(zhǎng)、原綠化處郭志強(qiáng)處長(zhǎng)、自然保護(hù)研究處陳玉芬處長(zhǎng)、園林綠化部譚鳳圓 、李燕珍和何銳榮以及樹木護(hù)理執(zhí)行隊(duì)張羽翀和陸家盛等技術(shù)人員的幫助，特此鳴謝。

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