張愛民+郭元虎+郝旺勝+馬振華

[摘要] 目的 探討斑貞1號(hào)聯(lián)合TMP、5-FU逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901/ADR與CDX2相關(guān)性。 方法 從2015年6—12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SGC7-901/ADR細(xì)胞培養(yǎng)，設(shè)①空白對(duì)照組、②5-FU組、③斑貞1號(hào)組、④5-FU+斑貞1號(hào)組、⑤5-FU+斑貞1號(hào)+ TMP組觀察細(xì)胞毒性，選取各個(gè)藥物組作用濃度分別提取總mRNA，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）監(jiān)測人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR細(xì)胞在不同藥物組的尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 對(duì)照組CDX2 mRNA 表達(dá)量為（2.01±0.26），5-FU組CDX2mRNA表達(dá)量為（1.94±0.24），5-FU組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而5-FU聯(lián)合斑貞1號(hào)及TMP處理組CDX2 mRNA表達(dá)量為（0.44±0.07），與其他組明顯降低比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 斑貞1號(hào)聯(lián)合TMP及5-FU逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞耐藥性可能與CDX2基因相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；斑貞1號(hào)；TMP； 5-FU； 多藥耐藥；CDX2基因

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）01（a）-0032-04

在我國，胃癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤前3[1]，手術(shù)治療一直是胃癌的首選治療手段，但除日本外的大多數(shù)國家早期診斷率較低，因此根治手術(shù)率仍然較低，化療在胃癌治療中顯得十分重要，但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）在胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。侯培珍[2]研究結(jié)果示斑貞1號(hào)、5-FU 和TMP聯(lián)合對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。該實(shí)驗(yàn)從2015年6—12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SGC7-901/ADR細(xì)胞培養(yǎng)，采用RT-PCR比較人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR細(xì)胞在不同藥物組CDX2mRNA的表達(dá)量，進(jìn)一步探討斑貞1號(hào) + 5-FU+TMP對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞的作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

細(xì)胞系胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞（人胃癌細(xì)胞）。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號(hào)”每mL含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU （規(guī)格10 mL：0.25 g，國藥準(zhǔn)字H310 20593）、TMP（規(guī)格40 mg，國藥準(zhǔn)字H20031302）、RPMI1640培養(yǎng)基（RPMI是Roswell Park Memorial Institute的縮寫，1640是培養(yǎng)基代號(hào)）。其中含有10%胎牛血清，二甲基亞砜、胰蛋白酶，新生小牛血清兩步法RT-PCR試劑盒，Trizol，引物，PCR擴(kuò)增儀、電泳儀（DF-D）、紫外分光度計(jì)、紫外透視成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞處理 以5×104/mL接種于6孔板上，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)孔依次加入等量的新的培養(yǎng)液； 5-FU稀釋液；斑貞1號(hào)稀釋液；斑貞1號(hào) + 5-FU稀釋液；斑貞1號(hào) + 5-FU+TMP稀釋液（選取各自的IC50值）。培養(yǎng)48 h后，PBS緩沖液沖洗，準(zhǔn)備提取總mRNA。

1.3.2 RT- PCR檢測 以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 每個(gè)反應(yīng)體系25 uL，目的基因引物各0.5 uL，Takara Taq 1 uL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus） 2.5 uL，dNTP Mixture 2 uL，ddH2O 13.5 uL；各樣品cDNA5 uL，β -action的正義列為5'-AGAGCGGCATGAAGAAGGAGTG-3'，反義列為5ˊ-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，CDX2基因序列的正義列引5-TCAGACCTACGCCGAATATGC-3，反義列引物為5'-GAAATGGGAGAAGGTAGTGTCAAA-3'，滅菌蒸餾水13.5 uL。預(yù)變性→變性→退火→延伸條件分別是、98℃、2～4 min→98℃、8 s→55℃、12 s→72℃、55 s，共30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束，取樣品10 uL，經(jīng)100 V恒壓，2%瓊脂糖電泳60 min，采集電泳圖像，凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描得出各電泳帶光密度值（即目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用LSD t檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC7901/ADR細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后CDX2 mRNA的表達(dá)

5-FU組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其他藥物組與對(duì)照組及組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離的表達(dá)

CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于247bp和548bp。A、B、C、D、E為CDX2表達(dá)，A1、B1、C1、D1、E1為β-action的表達(dá)。

3 討論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，至今為止手術(shù)仍是胃癌的主要治療方法。因早癌診斷率低，多數(shù)患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)，所以化療在胃癌治療中顯得十分重要，但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），郝旺勝等[3]研究發(fā)現(xiàn)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞對(duì)5-FU相對(duì)耐藥性為97.49%；有日本學(xué)者[4-5]發(fā)現(xiàn) CDX2 是腫瘤多藥耐藥性重要控制基因 MDR1 的直接上游基因通過構(gòu)建 CDX2 沉默的病毒載體轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性增加，將藥物泵出細(xì)胞的效率降低，胃癌細(xì)胞株的凋亡增加，并促使胃癌細(xì)胞停滯于 M 期；儲(chǔ)婧等[6]研究發(fā)現(xiàn)CDX2和腸型claudin- 3胃黏膜腸化生及腸型胃癌中表達(dá)具有相關(guān)性， Bae等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CDX2 的表達(dá)與結(jié)腸、直腸癌密切相關(guān)，且可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。Bonhomme 等[8]研究表明CDX2在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)， 能抑制腫瘤的發(fā)生且CDX2表達(dá)的減少與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良有關(guān)，Hong KD等[9-10] CDX2在結(jié)直腸癌中表達(dá)研究的分析結(jié)果，在高中分化癌組織中的表達(dá)明顯高于在低分化癌組織中的表達(dá)。肖燾等[11]研究發(fā)現(xiàn) C D X2屬于腸道特異性的核轉(zhuǎn)錄因子， 對(duì)腸上皮細(xì)胞正常形態(tài)和功能維持起一定的作用基因長度22～23 KB，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，參與腸道發(fā)育過程多個(gè)步驟調(diào)節(jié)，主要有細(xì)胞增殖、分化、遷移及惡變，在早期腸分化中起重要作用[12]；在正常狀態(tài)下其表達(dá)難以測定，但在內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、癌基因等多種刺激因子下，可明顯表達(dá)[13-14]。CDX2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，同時(shí)抑制機(jī)體抗腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)[15-16]，斑貞1號(hào)合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），主要斑蝥素主要是抑制腫瘤細(xì)胞核苷酸合成，起到解毒殺瘤、殺傷腫瘤同時(shí)無骨髓抑制作用。女貞子對(duì)染色體損傷具保護(hù)作用。TMP可通過多種途徑，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，對(duì)腫瘤起到治療作用。楊葉等[17]研究已證實(shí)TMP能顯著增加SGC-7901/ADR細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性；斑貞1號(hào)和TMP聯(lián)合5-FU對(duì)人胃癌細(xì)胞有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用。該研究顯示對(duì)照組CDX2 mRNA 表達(dá)量為（2.01±0.26），5-FU組CDX2mRNA表達(dá)量為（1.94±0.24），5-FU組與對(duì)照組比較COX-2mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明COX-2參與耐藥細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性。斑貞1號(hào)和TMP聯(lián)合5-FU組COX-2mRNA表達(dá)量為（0.44±0.07），明顯低于其他用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明可顯著抑制耐藥細(xì)胞COX-2mRNA的高表達(dá)，克服了由COX-2基因介導(dǎo)的多藥耐藥性，增強(qiáng)了治療效果。

綜上所述，斑貞1號(hào)聯(lián)合TMP及5-FU可以逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞耐藥性，并初步探討其影響人胃癌耐藥細(xì)胞株的分子機(jī)制，為胃癌耐藥性逆轉(zhuǎn)的基因治療打下理論基礎(chǔ)，值得推廣，體外試驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)是否能發(fā)揮相同的作用，有待于進(jìn)一步的研究和探討。如果實(shí)驗(yàn)條件允許，不僅局限于CDX2的研究，可以進(jìn)行多基因研究，此外選用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)就會(huì)更加完美。

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（收稿日期：2016-10-09）