周宇超 高曉彤 劉向偉 譚乃文 魏洪波 宋應(yīng)亮

目前，不受倫理學(xué)制約的間充質(zhì)干細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門種子細(xì)胞，而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)是其典型代表[1]。為了更好地控制干細(xì)胞的增殖分化進(jìn)而解決臨床問題，越來越多的研究集中于影響干細(xì)胞生存與功能的 “干細(xì)胞龕”[2-3]，例如細(xì)胞膜片技術(shù)就因在高度密集細(xì)胞的同時(shí)保存了豐富的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，從而為干細(xì)胞提供適宜微環(huán)境而受到人們青睞[4-5]，廣泛應(yīng)用于包括口腔領(lǐng)域在內(nèi)的多種組織器官再生[6-8]。而氧含量是干細(xì)胞龕的重要組成部分。不同于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的常氧環(huán)境，體內(nèi)各組織氧分壓往往較低[9]；脂肪組織中<3%[10]。因此，有學(xué)者提出低氧環(huán)境可能更貼近ADSCs的生理環(huán)境而更利于其生存。事實(shí)上，已有研究表明體外低氧培養(yǎng)會(huì)影響ADSCs的增殖、分化和功能[11-13]；但其對(duì)ADSCs細(xì)胞膜片的影響尚未見報(bào)道。

本研究利用不同濃度的氯化鈷(CoCl2)模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，觀察其對(duì)ADSCs膜片構(gòu)建和生物學(xué)特性的影響，以期找到ADSCs膜片體外培養(yǎng)的最適條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

OriCellTMC57BL/6小鼠ADSCs完全培養(yǎng)基(賽業(yè))；Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國(guó))；抗壞血酸(科昊)；六水合氯化鈷CoCl2、β- actin一抗(Sigma，美國(guó))； RIPA(Beyotime)；HIF- 1α一抗(三鷹)，抗兔、鼠二抗(博士德)；Trizol(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄、qPCR試劑盒(Takara)；引物合成(尼桑)。CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，德國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；qPCR儀(AB 7500，美國(guó))；垂直電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio- Rad，美國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板(Thermo,美國(guó))。C57BL/6小鼠(8 周，SPF級(jí))，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 ADSCs膜片的構(gòu)建

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng) 頸椎脫位處死小鼠，無菌條件下取腹股溝處腹腔內(nèi)脂肪，膠原酶消化法提取組織細(xì)胞。37 ℃，5%CO2細(xì)胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h換液，以后每3 d換液直至細(xì)胞融合80%～90%傳代。

1.2.2 ADSCs膜片的構(gòu)建 常規(guī)培養(yǎng)P3ADSCs至融合90%，加入成膜誘導(dǎo)液(ADSCs完全培養(yǎng)基+50 μg/ml Vit C)，以后每3 d換液。肉眼和倒置顯微鏡下觀察成膜情況。

1.3 CoCl2模擬低氧環(huán)境的劑量效應(yīng)

含不同濃度CoCl2(0、50、100 μmol/L)的完全培養(yǎng)基處理P3ADSCs 48 h。Trizol和RIPA裂解液分別提取總RNA和蛋白，用于qPCR和Western Blot。以β- actin為內(nèi)參檢測(cè)HIF- 1α的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄、qPCR反應(yīng)體系及條件、抗體稀釋及使用方法參照說明書。引物序列見表 1。

1.4 低氧環(huán)境對(duì)構(gòu)建ADSCs膜片的影響

成膜誘導(dǎo)過程中，分別添加0、50、100 μmol/L CoCl2。2 周后，用鑷子將細(xì)胞膜片小心揭起，常規(guī)處理切片，行組織學(xué)染色(HE染色和天狼星紅染色)或TEM觀察。

1.5 低氧環(huán)境對(duì)ADSCs及其細(xì)胞膜片特性和功能的影響

1.5.1 低氧環(huán)境對(duì)ADSCs干性的影響 不同程度低氧處理P3ADSCs 48 h，qPCR檢測(cè)干性相關(guān)基因Sox2，Oct4的表達(dá)情況。方法同上；引物序列見表 1。

1.5.2 低氧環(huán)境對(duì)ADSCs細(xì)胞膜片分泌功能的影響

成膜誘導(dǎo)1 周，期間施以不同濃度CoCl2處理，qPCR檢測(cè)膠原Col- Ⅰ、粘附分子Cdh1、保護(hù)性生長(zhǎng)因子bFGF和VEGF。方法同上；引物序列見表 1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多樣本間比較采用單因素方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。

表 1 qPCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs和ADSCs膜片的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下，分離培養(yǎng)獲得的第三代細(xì)胞為貼壁良好的梭形、三角形或多角形細(xì)胞(圖 1A)。

2.1.2 ADSCs膜片形態(tài)學(xué)觀察 隨成膜誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)板底部透明性逐漸降低而呈乳白色，誘導(dǎo)10 d左右，膜片邊緣開始向中部蜷曲；14 d后，可用鑷子將之完整揭下。揭下的膜片縮卷成團(tuán)(圖 1B、C)。倒置顯微鏡下，膜片中ADSCs 形態(tài)狹長(zhǎng)；密集生長(zhǎng)而排列成束(圖 1D)。

2.2 CoCl2體外模擬缺氧環(huán)境具有劑量效應(yīng)

qPCR和Western Blot結(jié)果顯示，同常氧對(duì)照組相比，CoCl2模擬低氧組高表達(dá)HIF- 1α且其表達(dá)量隨CoCl2濃度的增加而升高(圖 2)。

2.3 體外低氧環(huán)境對(duì)構(gòu)建ADSCs膜片的影響

2.3.1 組織學(xué)染色結(jié)果 HE染色可見，成膜誘導(dǎo)2 周后，ADSCs形成了“細(xì)胞-膠原纖維-細(xì)胞”的三明治樣結(jié)構(gòu)。而CoCl2模擬低氧組形成的細(xì)胞膜片明顯較對(duì)照組薄，主要表現(xiàn)為中間層膠原成分減少，而細(xì)胞數(shù)量未見明顯改變(圖 3A～C)。天狼星紅染色(圖 3D～F)結(jié)果類似，即低氧組膠原減少。

2.3.2 TEM觀察結(jié)果 常氧膜片組ADSCs胞漿和ECM中均有大量絲狀膠原纖維(圖 4A、D)。而低氧組明顯減少，且缺氧程度越重(CoCl2濃度越高)越少(圖 4)。但是，相較于對(duì)照組，低氧組的細(xì)胞連接顯著增加，尤其是輕度缺氧組不僅細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-ECM之間存在大量高密度細(xì)胞融合的阻射條帶，同一細(xì)胞胞膜反折處也形成密集的點(diǎn)狀或條帶狀連接(圖 4B、E)；高度缺氧組雖較低度缺氧組少，卻仍明顯多于對(duì)照組(圖 4C、F)。

圖 2 不同濃度CoCl2作用48 h對(duì)HIF- 1α表達(dá)的影響

A～C： HE染色(普通光學(xué)顯微鏡)； D～F： 天狼星紅染色，粉紅色部分為Ⅰ型膠原(偏振光顯微鏡)

2.4 低氧環(huán)境對(duì)ADSCs及其細(xì)胞膜片功能的影響

2.4.1 低氧環(huán)境提高ADSCs干性基因的表達(dá)

qPCR結(jié)果表明經(jīng)低氧處理的ADSCs對(duì)干性相關(guān)基因Sox2和Oct4的表達(dá)都明顯上調(diào)，且低氧程度越重(CoCl2濃度越高)上調(diào)越明顯(圖 5)。

2.4.2 低氧環(huán)境減少ADSCs細(xì)胞膜片中膠原的表達(dá)而提高黏附分子的表達(dá) 同TEM觀察結(jié)果一致，低氧組ADSCs膜片對(duì)Col- Ⅰ的表達(dá)降低，而參與形成黏附連接的主要蛋白成分E- Cadherin(Cdh1)的表達(dá)在低度缺氧組提高約1.7 倍，高度缺氧組提高約2.6 倍(圖 5)。

2.4.3 低氧環(huán)境促進(jìn)ADSCs細(xì)胞膜片生長(zhǎng)因子的表達(dá) 同對(duì)照組相比，各CoCl2處理組ADSCs細(xì)胞膜片對(duì)bFGF和VEGF的表達(dá)量都升高；且各濃度組兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 5)。

圖 4 TEM觀察ADSCs膜片超微結(jié)構(gòu)

圖 5 CoCl2作用48 h對(duì)ADSCs干性及功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

干細(xì)胞治療在多種醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景，但干細(xì)胞移植過程中的細(xì)胞流失和死亡極大地限制了療效。細(xì)胞膜片技術(shù)可解決單細(xì)胞移植中細(xì)胞流失問題[4-5]；而眾多關(guān)于干細(xì)胞龕的研究也提示從體外到體內(nèi)的驟然缺氧可能是導(dǎo)致移植干細(xì)胞死亡的主要原因[14]。本研究利用CoCl2在體外模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，探討其對(duì)ADSCs膜片構(gòu)建和生物學(xué)特性的影響。

HIF- 1α是組織低氧的標(biāo)志物[15]；而Co2+可通過細(xì)胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活、抑制細(xì)胞氧化反應(yīng)，從而達(dá)到模擬細(xì)胞缺氧的目的[16]。用梯度濃度的CoCl2處理ADSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CoCl2濃度的增加，ADSCs對(duì)HIF- 1α的表達(dá)的上調(diào)也越明顯，說明CoCl2能有效模擬低氧環(huán)境且具有劑量依賴性。

常氧條件下Vit C法能便捷地構(gòu)建細(xì)胞密集排列且富含ECM的ADSCs膜片[17]，在成膜誘導(dǎo)2 周時(shí)即可從培養(yǎng)皿中完整揭下。低氧環(huán)境中誘導(dǎo)相同時(shí)間后，由于ADSCs合成分泌的Col- Ⅰ減少，導(dǎo)致形成的膜片相對(duì)較?。坏て屑?xì)胞數(shù)量并不減少且細(xì)胞連接更緊密，標(biāo)志著其抵抗外源性破壞的能力增強(qiáng)。

CoCl2使ADSCs干性基因表達(dá)上調(diào)，提示低氧微環(huán)境更利于維持干細(xì)胞未分化特性；低氧下誘導(dǎo)形成的ADSCs膜片合成更多保護(hù)性生長(zhǎng)因子(bFGF，VEGF)，意味著該膜片在植入體內(nèi)時(shí)可能具有更強(qiáng)的生存能力。

綜上所述，在適當(dāng)?shù)脱醐h(huán)境下誘導(dǎo)形成的ADSCs膜片用于再生醫(yī)療可能會(huì)獲得更好的臨床效果。