李巖+劉云娜

摘 要：目的：探究環(huán)磷腺苷葡胺注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的可行性。方法：確定該供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值后，分別用兩種不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑對(duì)3批供試品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果：注射用環(huán)磷腺苷葡胺稀釋40倍時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法沒(méi)有干擾作用，細(xì)菌內(nèi)毒素限值符合規(guī)定。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏，可用此法代替原有的家兔熱原檢查法。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素；環(huán)磷腺苷葡胺；鱟試劑；干擾試驗(yàn)

環(huán)磷腺苷葡胺注射液是一種非洋地黃類強(qiáng)心劑，可用于冠心病、心肌梗死等，也可用于急性白血病的緩解治療[1-2]。《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定以家兔法進(jìn)行熱原檢查，但家兔法操作繁瑣，在實(shí)際情況中家兔體溫會(huì)有異常波動(dòng)，給檢驗(yàn)造成困難[3]。本文進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔法的可行性試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

注射用環(huán)磷腺苷葡胺（山東綠葉制藥有限公司，批號(hào)：201404198、201406074、201408367，規(guī)格：60 mg）。鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司提供，批號(hào)：0508215，規(guī)格：0.1 mL/支，靈敏度：0.125EU·mL-1；廈門(mén)鱟試劑廠提供，批號(hào)：0406345，規(guī)格：0.1 mL/支，靈敏度：0.125EU·mL-1）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水BET水（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：0909267，規(guī)格：5 mL/支）。

1.2. 方法

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值（L）的計(jì)算

根據(jù)公式L=K/M計(jì)算，L為供試品注射用環(huán)磷腺苷葡胺的細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值，K和M分別為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量和供試品劑量[4]，計(jì)算得出L=5EU·mg-1。

1.2.2 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD=C·L/λ計(jì)算，L為供試品注射用環(huán)磷腺苷葡胺的細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值，C為供試品稀釋后的樣品濃度，λ為鱟試劑的靈敏度值，計(jì)算出1g·L-1的環(huán)磷腺苷葡胺溶液的MCD=40。

1.2.3 供試品的最大不干擾濃度的干擾試驗(yàn)

用BET水將供試品梯度稀釋成0.10 g·L-1、0.05 g·L-1、0.025 g·L-1、0.0125 g·L-1、0.00625 g·L-1共5種濃度的稀釋液。同時(shí)配制供試品陽(yáng)性溶液，供試品陽(yáng)性溶液為上述各溶液分別添加2λ（0.25EU·mL-1）的細(xì)菌內(nèi)毒素樣品溶液制成。將鱟試劑用0.1 mLBET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各稀釋濃度的供試品樣品溶液和供試品陽(yáng)性溶液，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37℃孵育1h后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以此初步確定供試品的最大不干擾濃度[5]。

1.2.4 供試品的最大不干擾濃度的確證試驗(yàn)

根據(jù)上述干擾試驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)選擇0.025g·L-1濃度的供試品稀釋溶液。用BET水和0.025g·L-1供試品溶液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為0.25 EU·ml-1、0.125 EU·ml-1、0.0625 EU·ml-1和0.03125EU·ml-1共4種濃度的稀釋液。將鱟試劑用0.1 mL BET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各濃度稀釋液，37℃孵育1h后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)

將供試品用BET水配制成0.025g·L-1的稀釋液，并同時(shí)設(shè)置試品陽(yáng)性對(duì)照（2λ）、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（2λ），將鱟試劑用0.1 mL BET水溶解后，分別加入0.1 mL上述配制的各濃度稀釋液，37℃孵育1h后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 供試品的最大不干擾濃度的干擾試驗(yàn)

結(jié)果顯示各稀釋濃度對(duì)鱟試劑均無(wú)干擾反應(yīng)，由于計(jì)算出1g·L-1的環(huán)磷腺苷葡胺溶液的理論MCD為40，因此初步確定供試品的最終有效稀釋濃度為0.025g·L-1，詳見(jiàn)表1。

2.2 供試品的最大不干擾濃度的確證試驗(yàn)

結(jié)果顯示，供試品的稀釋濃度為0.025g·L-1，對(duì)兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑均沒(méi)有產(chǎn)生干擾反應(yīng)，詳見(jiàn)表2。

2.3 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)

結(jié)果顯示對(duì)3批環(huán)磷腺苷葡胺注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，可以用稀釋方法排除干擾，測(cè)定結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定，詳見(jiàn)表3。

3.討論

鱟試劑是一種公認(rèn)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用試劑，可廣泛用于化學(xué)藥、中藥、生物制品等藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)[6]。但許多藥品對(duì)凝集反應(yīng)具有一定的增強(qiáng)或減弱的干擾作用，使其結(jié)果并不準(zhǔn)確，只有驗(yàn)證了供試品的稀釋濃度對(duì)上述凝集反應(yīng)沒(méi)有干擾作用，鱟試劑的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果才具有準(zhǔn)確性和可信性。本文研究結(jié)果顯示供試品的稀釋濃度為0.025g·L-1，對(duì)兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑均沒(méi)有產(chǎn)生干擾反應(yīng)，且40倍的注射用環(huán)磷腺苷細(xì)菌內(nèi)毒素含量低于理論限值5EU·mg-1，表明用鱟試劑法檢測(cè)該供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素這一方案是可行的。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用此法代替原有的家兔熱原檢查法以達(dá)到安全用藥的目的。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳世斌， 安麗娟， 孫林， 等. 環(huán)磷腺苷葡胺注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志， 2012， 33（3）：287-302.

[2] 王玉華， 李麗萍， 劉茜. 注射用環(huán)磷腺苷葡胺細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J]. 齊魯藥事， 2011， 30（3）：146-147.

[3] 楊娟， 李界剛， 朱愛(ài). 環(huán)磷腺昔注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法探討[J]. 中國(guó)藥師， 2013， 16（1）：144-145.

[4] 蔡彤， 張國(guó)來(lái)， 李波等. 84種注射用藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2010， 45（2）：150-155.

[5] 黃麗榮，許善初，石慶平. 注射用環(huán)磷腺苷細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立[J]. 安徽醫(yī)藥， 2006， 10（8）：567-568.

[6] 王宗春， 郭咸希. 注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2013， 35（4）：480-483.

作者簡(jiǎn)介：李巖，單位：黑龍江威凱洱生物技術(shù)有限公司，職稱：助理工程師，單位郵編：150028，學(xué)歷：本科，1981年出生。