單體霞++廉玉姬

摘要：為了了解高溫和利巴韋林處理對(duì)馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）卷葉病毒（Potato leave-roll virus， PLRV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Y virus，PYV）脫毒的影響，以寶塔百利、紅王和“803”為材料，采用高溫和化學(xué)處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)技術(shù)對(duì)上述馬鈴薯進(jìn)行處理，采用RT-PCR方法檢測(cè)病毒基因。結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理抑制馬鈴薯組培苗的生長(zhǎng)，“803”的存活率最高為80.1%，寶塔百利的存活率最低為41.1%；利巴韋林對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的抑制作用較明顯，其濃度超過(guò) 75 mg/L時(shí)生根效果差，到125 mg/L時(shí)對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)抑制效果最明顯；RT-PCR結(jié)果顯示，高溫處理結(jié)合利巴韋林的處理上均未檢測(cè)到病毒。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosun L.）；高溫處理；利巴韋林；電泳； PLRV；PYV

中圖分類號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）21-5469-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.009

Effects of PLRV and PYV Virus Elimination from in Vitro Potato by

Thermotherapy Combined with Ribavirin

SHAN Ti-xia， LIAN Yu-ji

（College of Life Sciences， Linyi University，Linyi 276005，Shandong， China）

Abstract： To investigate the effect of high temperature combined with ribavirin on elimination of potato leaf roll virus （PLRV） and potato virus Y（PYV），shoot tip culture of potato genotype Red king，Bora Valley and 803 were used for virus elimination studies. Virus status in vitro plantlets was determined by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results showed that， the glowth of tissue cultured seedings were inhibited after highest temperature（35±1） ℃ treatment and there were the highest survival rates（80.1%） of 803 and the lowest （41.1%） survival rates of Bora Valley. Ribaribin had significant inhibitory effect on growth of potato，when its concentration was more than 75 mg/L，rooting rate was low， and when reached 125 mg/L， inhibitory effect on potato growth was the most obvious. RT-PCR results showed that，the high temperature combined with ribaribin treatment （25～125 mg/L） could effectively eliminate PLYV and PYV.

Key words： potato（Solanum tuberosum L.）； high temperature treatment； ribavirin； electrophoresis； PLYV； PYV

馬鈴薯（S. tuberosum L.）是茄科茄屬一年生草本植物，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織確認(rèn)為世界四大主糧之一，是重要的糧食、蔬菜兼用作物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。近年來(lái)，中國(guó)也已啟動(dòng)實(shí)施了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，市場(chǎng)對(duì)馬鈴薯的需求隨之逐漸增多，馬鈴薯的栽培面積不斷擴(kuò)大。但是長(zhǎng)期以來(lái)有“植物癌癥”之稱的病毒病一直困擾著馬鈴薯的生產(chǎn)發(fā)展[2]。馬鈴薯是以營(yíng)養(yǎng)器官繁殖的無(wú)性繁殖作物，在栽培過(guò)程中一旦感染了病毒，就會(huì)在植株體內(nèi)增殖，并通過(guò)輸導(dǎo)組織運(yùn)轉(zhuǎn)、積累到新生營(yíng)養(yǎng)器官中，導(dǎo)致馬鈴薯植株生長(zhǎng)衰退、植株變矮、葉面皺縮、葉片出現(xiàn)黃綠相間的嵌斑，甚至葉脈壞死直至整個(gè)復(fù)葉脫落、塊莖小或出現(xiàn)尖頭龜裂，使產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，這種現(xiàn)象稱為馬鈴薯的退化。種薯退化是引起產(chǎn)量降低和商品性狀變差的主要原因，全世界每年由馬鈴薯病毒造成的減產(chǎn)至少為20%。中國(guó)由于馬鈴薯病毒病的危害造成的馬鈴薯減產(chǎn)達(dá)到50%～70%[3]。

理論上，植物分生組織的維管組織還不健全，從而抑制了病毒向分生組織的增殖；分生組織中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素水平均很高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制了病毒的合成；在植物分生組織中缺乏或尚未構(gòu)建病毒的復(fù)制所需要的酶系統(tǒng)，因而病毒無(wú)法在分生組織中復(fù)制。因此，通過(guò)植物頂端分生組織培養(yǎng)可有效抑制一些病毒的復(fù)制。早在20世紀(jì)70年代，中國(guó)就已開(kāi)展了馬鈴薯莖尖脫毒及其良種繁育技術(shù)的研究，在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用取得了顯著的增產(chǎn)效益，但是由于種薯繁殖成本較高，加之良種繁育體系不健全等原因，脫毒種薯在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用非常緩慢[4]。

目前，獲得脫毒馬鈴薯苗的方法主要有物理方法、化學(xué)方法、愈傷組織培養(yǎng)包括利用實(shí)生種子生產(chǎn)等[5]。其中的物理方法包括低溫、高溫、X射線處理等，而熱處理是最古老有效的方法，植物和病毒對(duì)溫度的敏感性是不同的，在高于正常的溫度下，植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化，但很少傷害甚至不傷害寄生組織[6]。

利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷，為鳥(niǎo)苷類化合物，1972年首次合成，對(duì)RNA病毒和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性，此后利巴韋林也用于植物脫毒方面的研究[7-12]。利巴韋林是一種常用的病毒滅活劑，且價(jià)格低廉，如若處理效果好可能會(huì)應(yīng)用到農(nóng)業(yè)上，這無(wú)疑是非常有意義的。

本試驗(yàn)采用莖尖培養(yǎng)、高溫處理、化學(xué)處理相結(jié)合的方法，對(duì)馬鈴薯品種寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）進(jìn)行脫毒處理，通過(guò)PCR方法檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒（Potato leave-roll virus，PLRV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Y virus，PYV）基因，探索高溫和不同濃度利巴韋林處理對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響，探究高溫和利巴韋林最佳搭配條件對(duì)馬鈴薯脫毒的影響，從而找到對(duì)馬鈴薯有效方便的脫毒技術(shù)，旨在為馬鈴薯的大規(guī)模增產(chǎn)增收提供可能，為馬鈴薯的脫毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯中有寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）3個(gè)品種；利巴韋林（辰欣藥業(yè)股份有限公司）購(gòu)于山東省臨沂市康源大藥店。

1.2 方法

1.2.1 莖尖培養(yǎng)與高溫處理 取寶塔百利、紅王、“803”（荷蘭系列）3個(gè)馬鈴薯品種的頂芽，切取大約1 cm的莖尖，莖尖用洗衣粉或洗滌劑清洗粘在表面的灰塵和微生物，再用自來(lái)水流水沖洗1～2 h，用紗布或?yàn)V紙吸干。在超凈工作臺(tái)上先用70%乙醇浸潤(rùn)15～20 s，再用2%次氯酸鈉滅菌10 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。將莖尖放在20倍的解剖鏡下進(jìn)行莖尖剝離，剝下帶1～2個(gè)葉原基的莖尖后立即接種在莖尖培養(yǎng)基上。莖尖培養(yǎng)基：MS添加0.2 mg/L GA3，0.1 mg/L NAA和0.5 mg/L BA。每個(gè)試管接種一個(gè)莖尖，并作好編號(hào)和記錄。培養(yǎng)條件為：（25±1） ℃、16 h/d光培養(yǎng)、光量子通量密度4 000 μmol/（m2/s）。試驗(yàn)剝離30個(gè)莖尖，重復(fù)3次。培養(yǎng)5周后統(tǒng)計(jì)莖尖的存活率、出芽率、污染率。

莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)出的芽生長(zhǎng)至5～10 cm，取1～2個(gè)節(jié)間的莖段轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶接種8個(gè)莖段，并作好編號(hào)和記錄。于（35±1） ℃、16 h/d光培養(yǎng)、光量子通量密度4 000 μmol/（m2·s）下培養(yǎng)30 d。試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)莖段的存活率。

1.2.2 利巴韋林處理及植物培養(yǎng) 待培養(yǎng)60 d后，可獲得3～5 cm的小芽。將小芽切成1 cm的莖段，并將其接種到已經(jīng)用不同濃度（0、25、50、75、100、125 mg/L）利巴韋林處理過(guò)的液體MS培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中。每個(gè)處理培養(yǎng)3瓶，共54瓶。然后再培養(yǎng)室條件下培養(yǎng)30 d。觀察并記錄馬鈴薯組培苗的生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 總RNA提取與cDNA的合成與基因擴(kuò)增 取固體培養(yǎng)基上處理過(guò)的馬鈴薯組培苗幼葉（<100 mg）提取總RNA，提取方法按照Invitrogen公司Trizol Reagent的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA的合成利用TaKaRa公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用合成的cDNA與TaKaRa公司的PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增基因，其反應(yīng)程序?yàn)閷CR反應(yīng)產(chǎn)物在94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度55 ℃保持40 s，使引物與模板充分退火，在72 ℃保持30 s，重復(fù)循環(huán)30次；在72 ℃保持10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列 PLRV：上游5′-cgcgctaacagagttcagcc-3′，下游5′-gcaatgggggtccaactcat-3′（336 bp）；PYV：上游5′-cacgattgctcaagcaagaa-3′，下游5′-ggcggagtatgcaccaagta-3′（412 bp）。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖培養(yǎng)

3個(gè)馬鈴薯品種莖尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周時(shí)開(kāi)始形成愈傷組織，培養(yǎng)60 d左右開(kāi)始分化出小芽，但小芽出芽率不高，品種間存活率差異不大（表1）。1個(gè)月后，將分化的小芽轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基后，在35 ℃下連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，大部分小芽變黃，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)30 d后，“803”的存活率最高，達(dá)到80.1%，紅王和寶塔百利小芽的存活率低于50%，表明持續(xù)的高溫處理影響馬鈴薯組培苗的生長(zhǎng)。

不同濃度利巴韋林處理對(duì)馬鈴薯組培苗的生長(zhǎng)影響差異比較明顯。在液體培養(yǎng)條件下，隨著利巴韋林濃度的增高，對(duì)組培苗生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)，株高隨濃度增加而逐漸減小。當(dāng)利巴韋林濃度為 0 mg/L，即僅經(jīng)過(guò)高溫處理的植株的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，50 mg/L利巴韋林處理的植株生長(zhǎng)良好，但無(wú)根或短小，75 mg/L利巴韋林處理后僅有紅王生出短小的根，75 mg/L以上利巴韋林處理的3種馬鈴薯均無(wú)根。利巴韋林濃度超過(guò)75 mg/L時(shí)，所有植株比較脆，用鑷子取的時(shí)候非常容易斷裂并碎成小塊，明顯抑制植株的生長(zhǎng)。此外，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)紅王經(jīng)100和125 mg/L利巴韋林處理后，植株在切口處生長(zhǎng)出微型薯；“803”經(jīng)50 mg/L利巴韋林處理后的生長(zhǎng)要差于另外2個(gè)品種，經(jīng)75 mg/L及以上濃度的利巴韋林處理后生長(zhǎng)受到明顯抑制，基本停止生長(zhǎng)甚至黃化死亡。在固體培養(yǎng)條件下，利巴韋林對(duì)馬鈴薯組培苗生長(zhǎng)的抑制效果與液體培養(yǎng)方法相似，但根系生長(zhǎng)良好（表2）。除“803”外，其他2個(gè)品種在100 mg/L利巴韋林處理中也能生根，未觀察到變黃枯萎植株。

2.2 不同濃度利巴韋林處理對(duì)3種馬鈴薯品種的PYV、PLRV的抑制影響

PLRV和PYV的RT-PCR結(jié)果顯示，125 mg/L利巴韋林處理后的3種馬鈴薯試管苗均未顯示病毒條帶（圖1），與此相反，陽(yáng)性對(duì)照上分別顯示病毒基因條帶，說(shuō)明利巴韋林對(duì)病毒有抑制作用。

經(jīng)高溫處理后生存的紅王、“803”、寶塔百利在不同濃度利巴韋林處理的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后均未觀察到病毒基因條帶（圖1），說(shuō)明高溫?zé)崽幚韺?duì)去除馬鈴薯病毒有一定作用。而不同濃度的利巴韋林處理的馬鈴薯，雖然高濃度（高于50 mg/L）會(huì)影響馬鈴薯的生長(zhǎng)分化，但其對(duì)馬鈴薯的PLRV、PYV病毒抑制作用卻是顯而易見(jiàn)的。檢測(cè)后，選擇高濃度利巴韋林處理過(guò)的植株轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室中進(jìn)行回復(fù)生長(zhǎng)。單獨(dú)熱處理或單獨(dú)化學(xué)處理都未能有效去除馬鈴薯病毒[13]，而通過(guò)外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、高溫處理和化學(xué)試劑的共同作用則為解決這一問(wèn)題提供了一個(gè)很有效的途徑，為未來(lái)植物脫毒提供了良好的借鑒意義。

3 討論

馬鈴薯是世界上重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，但病害一直是限制馬鈴薯生產(chǎn)的主要因素，其中病毒病影響馬鈴薯的質(zhì)量， 導(dǎo)致品種嚴(yán)重退化[1]。在發(fā)展中國(guó)家馬鈴薯因病害每年導(dǎo)致數(shù)億美元的損失[14，15]，脫毒馬鈴薯種薯可大大提高馬鈴薯產(chǎn)量，增加農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。利用物理和化學(xué)相結(jié)合的方法處理植物，在有效鈍化病毒復(fù)制的同時(shí)又不會(huì)對(duì)植物造成較大的傷害，并以此獲得脫毒苗的研究很早就已經(jīng)開(kāi)始，其中物理方法中的高溫處理是比較有效的[16，17]。本試驗(yàn)中35 ℃處理馬鈴薯1個(gè)月可以明顯地去除馬鈴薯PYV，這與Faccioli等[18]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)35 ℃處理馬鈴薯16～27 d可以脫去PLRV和PYV。但是Mahmoud等[19]發(fā)現(xiàn)37 ℃處理馬鈴薯30～40 d不能有效地除去馬鈴薯病毒。本試驗(yàn)中35 ℃處理馬鈴薯1個(gè)月后得到的馬鈴薯苗生長(zhǎng)狀況良好，也未有檢測(cè)到PYV，這可以說(shuō)明1個(gè)月的處理時(shí)間是十分合理也是十分有效的。雖然本次試驗(yàn)無(wú)法證明高溫處理可否去除PLRV，但是已有很多研究發(fā)現(xiàn)高溫條件下可以脫除PLRV。

利巴韋林是一種常見(jiàn)的廣譜抗病毒藥物，可應(yīng)用于馬鈴薯的脫毒。Cassells等[16]將利巴韋林加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)馬鈴薯分生組織和外植體，可有效去除馬鈴薯的X、Y、S和M病毒。Asjes等[14]采用莖尖脫毒加熱處理結(jié)合40 mg/L利巴韋林處理的方法獲得脫毒苗。同時(shí)Klien等[17]研究發(fā)現(xiàn)利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)和利巴韋林處理能夠有效地去除PLRV和PYV，但莖尖的分化與生長(zhǎng)受到抑制。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利巴韋林對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定抑制作用，當(dāng)利巴韋林濃度為50 mg/L時(shí)馬鈴薯組培苗生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)利巴韋林濃度達(dá)到75 mg/L或更高濃度時(shí)，其對(duì)馬鈴薯組培苗生長(zhǎng)的抑制效果更明顯，有的停止生長(zhǎng)，甚至黃化死亡。但在50 mg/L利巴韋林處理后未檢測(cè)到PLRV和PYV病毒條帶，這說(shuō)明50 mg/L的濃度也可有效地去除PLRV和PYV。

本研究結(jié)果表明，將莖尖培養(yǎng)后獲得的小植株轉(zhuǎn)移到35 ℃下持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，最后取高溫處理苗莖尖并添加50 mg/L左右利巴韋林處理可有效去除馬鈴薯PLRV和PYV?？傊?，單一的莖尖培養(yǎng)技術(shù)不能有效地獲得脫毒植株。在獲得脫毒馬鈴薯時(shí)，可以取其大約1 cm的莖尖，在35 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月（30 d），然后再次取其大約1 cm的莖尖，嘗試用低于50 mg/L的利巴韋林處理，這應(yīng)該是一種簡(jiǎn)單有效的方法，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。這種技術(shù)對(duì)獲得脫毒馬鈴薯，提高馬鈴薯的產(chǎn)量，滿足市場(chǎng)需求，增強(qiáng)中國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)在世界上的競(jìng)爭(zhēng)力具有十分重要的意義。

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