梁祥森　甘耐炎　呂凱

摘要：目的 初步探討非小細胞肺癌（NSCLC）組織中SP70抗原表達的臨床意義。方法 采用RT-PCR法檢測40例肺癌組織（NSCLC 32例，小細胞肺癌8例）和20例肺良性病變組織中SP70抗原表達的相對水平，半定量分析其臨床意義。結(jié)果 肺癌組SP70平均表達水平明顯高于肺良性病變組（P<0.05）；NSCLC組（n=32）SP70平均表達水平高于小細胞肺癌組（n=8）（P<0.05）；SP70的表達水平與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤臨床分期均無關(guān)（P均>0.05）。結(jié)論 SP70可能是評價NSCLC的一個潛在的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：SP70抗原；非小細胞肺癌；RT-PCR

Abstract：Objective To investigate the non-small cell lung cancer（NSCLC） clinical significance of expression of SP70 antigen in tissues.Methods RT-PCR method was used to detect 40 cases of lung cancer（32 cases，NSCLC 8 cases of small cell lung cancer） relative to the level of expression of SP70 antigen and 20 cases of benign lung lesion，semi quantitative analysis and its clinical significance.Results The mean level of SP70 in lung cancer group was significantly higher than that in benign lung disease group （P<0.05）；NSCLC group （n=32） higher than the mean level of SP70 in small cell lung cancer group[（n=8）（P<0.05）；the expression level of SP70 in patients with gender，age，lymph node metastasis，clinical stage of tumor were independent （P >0.05）.Conclusion SP70 may be a potential indicator of NSCLC.

Key words：SP70 antigen；Non small cell lung cancer；RT-PCR

非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%，其死因大多是由于肺癌早期診斷率低且預(yù)后差[1]，尋求肺癌早期檢測指標(biāo)及方法成為目前研究熱點。近年來，潘世揚等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)一株能特異性識別NSCLC的McAbNJ00l，此抗體對NSCLC的免疫性診斷和治療意義重大，其所針對的靶抗原為相對分子質(zhì)量70000的胞漿新抗原SP70，SP70與NSCLC關(guān)系密切。本實驗采用RT-PCR法檢測40例NSCLC組織和15例良性病變肺組織中SP70的表達水平，分析其表達與臨床特征的關(guān)系，評價其在臨床診治中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 取我院2014年3月～2015年3月手術(shù)切除的未經(jīng)放化療的肺腫瘤標(biāo)本40例，另取20例手術(shù)切除的肺良性病變組織作為對照，全部標(biāo)本均有病理確診，收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。引物由北京諾賽基因公司設(shè)計并合成，目的基因SP70 F：5′-CCAGTTCAAGTGCTCGGCAT-3′；R：5′-TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3′。內(nèi)參β-actin F：5′GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′；R：5′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。

1.2實驗方法 按Trizol裂解抽提法進行總RNA的提取。常規(guī)檢測RNA的濃度、純度及完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA存放-20℃冰箱備用。25μl RT-PCR擴增體系：PCR reaction mixture 12.5 μl，上、下游引物（10 pmol/μl）各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10.5 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30個循環(huán)，每份樣本重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用灰度值表示，以β-actin灰度值為參照，標(biāo)化計算各樣本數(shù)據(jù)，從而獲得SP70的相對模板數(shù)，即：SP70/β-actin。計量資料采用（x±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1目的片段 將PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析證實PCR產(chǎn)物長度與目標(biāo)基因SP70長度一致，最后經(jīng)測序確認(rèn)為目的產(chǎn)物，如圖1。

2.2 SP70的表達比較 肺癌組SP70平均表達水平明顯高于肺良性病變組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；NSCLC組（n=32）SP70平均表達水平高于小細胞肺癌組（n=8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；SP70的表達水平與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

3 討論

相關(guān)研究[2-4]指出SP70是一種針對NSCLC的特異性蛋白靶標(biāo)，其存在于癌細胞的胞膜和胞漿，可促進癌細胞增殖，是肺癌檢測診斷的分子靶標(biāo)，同時也是抗肺癌治療靶點，SP70對于肺癌的診治意義重大。彭蘡[4]等采用ELISA方法檢測NSCLC患者中外周血液中SP70的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC組SP70陽性率明顯高于對照組，提示SP70可能是診斷NSCLC的潛在血清腫瘤標(biāo)志物。亦有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中SP70的檢出率明顯增高，而且NSCLC患者胸腔積液中SP70檢出率高于小細胞肺癌。截止目前，對肺癌組織中SP70表達水平的相關(guān)研究尚未有報道，本實驗直接提取肺癌組織，采用RT-PCR法檢測肺癌組織中SP70的mRNA水平，基因?qū)用鎸P70基因進行研究，對mRNA的檢測可以提高實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從而進一步證實SP70與NSCLC發(fā)生的關(guān)系及其與臨床組織病理學(xué)特征的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組SP70平均表達水平明顯高于肺良性病變組（P<0.05），NSCLC組平均表達水平又高于小細胞肺癌組，與相關(guān)研究[4]結(jié)論一致，進一步證實了SP70與NSCLC的密切關(guān)系，提示SP70可能是診斷NSCLC的潛在指標(biāo)。本實驗中內(nèi)參β-actin在各檢測樣本中均為陽性表達，證明樣本質(zhì)量良好，實驗數(shù)據(jù)可靠。本實驗利用內(nèi)參對實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)化處理后再進行統(tǒng)計分析，校正了各樣品之間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，使實驗結(jié)果更加真實可靠，由此得出的結(jié)論更加接近實際。但是，多數(shù)基因是通過蛋白的表達來發(fā)揮作用，本實驗檢測的mRNA基于基因水平，從mRNA到蛋白中間翻譯、修飾過程中可能存在mRNA/蛋白水平倒置現(xiàn)象[8]，需后續(xù)試驗進一步驗證。另外，SP70抗原在胞漿中和胞膜上均有表達，胞漿中表達量更豐富，抗癌藥物的作用靶點更為廣泛，其潛在臨床意義重大，但其抑癌作用機制，仍有待于進一步研究探討。

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編輯/楊倩