陳孟毅++林帥++杜朋++李程程++孟愛民

[摘要] 目的 建立小鼠博來(lái)霉素氣管多次給藥肺纖維化模型。 方法 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠45只，按體重隨機(jī)分為未處理組（5只）和處理組（40只），未處理組小鼠不經(jīng)處理，處理組小鼠博來(lái)霉素氣管給藥（0.4 mg/mL），2周給藥1次，共8次。處理組小鼠在初次給藥后2周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)分別取出肺組織稱重計(jì)算肺系數(shù)、固定做HE染色和Masson染色，制備冰凍切片進(jìn)行細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色。 結(jié)果 與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在給藥2周時(shí)肺系數(shù)顯著升高（P < 0.05）；同時(shí)，肺組織病理觀察結(jié)果顯示，給藥2周時(shí)，小鼠肺泡腔內(nèi)滲出和血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)較為嚴(yán)重，病理評(píng)分與未處理組小鼠比較顯著升高（P < 0.05）。此外，處理組小鼠在給藥2周、2個(gè)月與4個(gè)月時(shí)肺泡間隔增寬相對(duì)穩(wěn)定，與未處理組小鼠比較，病理評(píng)分顯著升高（P < 0.05），但胞漿滲出逐漸減少、炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，評(píng)分接近未處理組小鼠水平；膠原染色結(jié)果顯示處理組小鼠在給藥2周時(shí)出現(xiàn)藍(lán)綠色的膠原纖維，并在1、2、4個(gè)月時(shí)膠原纖維持續(xù)存在；SA-β-Gal染色結(jié)果表明，與未處理組小鼠比較，博來(lái)霉素氣管給藥4個(gè)月時(shí)小鼠的肺組織中衰老細(xì)胞明顯增多。 結(jié)論 博來(lái)霉素氣管多次給藥可以建立小鼠肺纖維化模型，且模型小鼠具有肺纖維化進(jìn)展不可逆、炎性反應(yīng)明顯減少兩個(gè)重要特點(diǎn)，并提示肺纖維化與衰老細(xì)胞有一定關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 博來(lái)霉素；纖維化；肺；模型

[中圖分類號(hào)] R563.02；R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（b）-0008-04

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明、以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的慢性疾病[1-2]。臨床上除肺移植外無(wú)有效的治療手段[3-4]，且預(yù)后極差，動(dòng)物肺纖維化模型在肺纖維化機(jī)制及其防治研究中非常重要。二氧化硅[5]、石棉、博來(lái)霉素[6]（BLM）等都能誘導(dǎo)肺纖維化，常用BLM誘導(dǎo)肺纖維化模型[7]，BLM氣管給藥是最常用的方式[8]，氣管給藥又分為氣管插管和氣管滴注。有文獻(xiàn)報(bào)道BLM單次給藥模型在給藥6周后，小鼠肺損傷部位有明顯修復(fù)[9]，與人類肺纖維化疾病的發(fā)展過(guò)程不同；病理學(xué)表現(xiàn)也不相同，人肺纖維化疾病的肺損傷部位細(xì)胞外基質(zhì)的沉積增多，中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)不突出[10]，而單次給藥肺纖維化模型中常有明顯的嗜中性粒細(xì)胞的炎性反應(yīng)[11]，并有文獻(xiàn)顯示經(jīng)單次給藥肺纖維化模型篩選出的藥物治療方案，在臨床上多數(shù)是無(wú)效的[12]?；谝陨弦蛩兀P者在參閱相關(guān)文獻(xiàn)后，擬采用BLM氣管滴注多次給藥方式造成小鼠肺持續(xù)性損傷，希望制備更符合人體IPF發(fā)病情況的BLM肺纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠45只（SPF級(jí)），體重20～22 g，10～12周，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[動(dòng)物合格證：SCXK（京）2015-0035]，動(dòng)物飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房屏障環(huán)境內(nèi)，溫度20～26℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 試劑

注射用鹽酸BLM：日本化藥株式會(huì)社；鹽酸氯胺酮注射液：沈陽(yáng)市獸藥廠；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天；核固紅染色液（0.5%）：北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型建立

14周齡C57BL/6J雄性小鼠按體重隨機(jī)分為未處理組（5只）和處理組（40只），處理組氣管滴注BLM溶液（0.4 mg/mL，每只100 μL），未處理組小鼠不經(jīng)處理，處理組小鼠用注射用鹽酸氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露聲門，用接套管的1 mL注射器氣管給藥。2周給藥1次，共8次，初次給藥后2周（0.5個(gè)月）、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)取肺組織。

1.4 HE染色

肺組織10%中性甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切片5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，普通光學(xué)顯微鏡（BX50，Olympus，Japan）觀察肺組織病變，病理學(xué)鏡檢人員單盲評(píng)分。

1.5 Masson染色

石蠟切片脫蠟，水洗，Masson染色復(fù)合液染色5 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，1%磷鎢酸浸洗，亮綠染色液染色15 min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻脫水、透明、固封。

1.6 肺系數(shù)

肺系數(shù)=肺組織重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.7 冰凍切片

小鼠在BLM初次給藥0.5、1、2、4個(gè)月取右肺中葉，速凍后將肺組織浸沒(méi)在適量包埋劑中，冰凍切片機(jī)制作8 μm的切片。

1.8 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法

冰凍切片固定液固定15 min，PBS洗3次，每次3 min，配染色液，滴加到切片上，37℃培養(yǎng)箱（無(wú)CO2）過(guò)夜，PBS洗后核固紅（0.5%）復(fù)染15 min。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 博來(lái)霉素多次給藥對(duì)小鼠體重的影響

處理組小鼠第1次BLM給藥為0周，小鼠每周稱重1次。未處理組小鼠整體上體重呈逐漸上升趨勢(shì)。與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM第1次給藥（0周）后體重下降，初次給藥1周時(shí)體重處于最低點(diǎn)，隨后體重逐漸增加，在第5周時(shí)接近未處理組小鼠體重，之后與未處理組小鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，在12周時(shí)體重超過(guò)未處理組小鼠（圖1）。

2.2 博來(lái)霉素多次給藥過(guò)程中肺系數(shù)的變化

處理組小鼠在0.5、1、2、4個(gè)月時(shí)的肺系數(shù)有高于未處理組小鼠的趨勢(shì)，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠0.5個(gè)月時(shí)肺系數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；且處理組小鼠在0.5個(gè)月時(shí)具有高于1、2、4個(gè)月時(shí)肺系數(shù)的趨勢(shì)（圖2）。

2.3 博來(lái)霉素多次給藥肺組織病理學(xué)改變

根據(jù)HE染色結(jié)果，對(duì)肺組織病理學(xué)評(píng)分：由0～12分組成，3個(gè)分類評(píng)價(jià)指標(biāo)[13]：肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)纖維化滲出的嚴(yán)重度、血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)的程度，每種分類分為：0分正常；1分輕度；2分中度；3分重度；4分極重度。合并后記分。

圖3顯示，BLM給藥過(guò)程中，小鼠在給藥后0.5、1、2、4個(gè)月時(shí)肺組織肺泡腔胞漿滲出逐漸減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)依次減弱，但肺泡間隔增寬沒(méi)有明顯變化。

A.未處理組；B.0.5個(gè)月；C.1個(gè)月；D.2個(gè)月；E.4個(gè)月

圖3 小鼠肺組織HE染色（100×）

從總分來(lái)看，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在BLM初次給藥后0.5、1、4個(gè)月的評(píng)分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。從單項(xiàng)評(píng)分來(lái)看，①肺泡間隔增寬：與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、2、4個(gè)月評(píng)分顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；②肺泡腔內(nèi)滲出：0.5個(gè)月時(shí)處理組小鼠分?jǐn)?shù)高于其他三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在0.5、4個(gè)月時(shí)評(píng)分顯著升高（P < 0.01）；③血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)：處理組小鼠0.5個(gè)月時(shí)與未處理組小鼠比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），4個(gè)月時(shí)處理組小鼠與未處理組小鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)水平接近。見表1。

2.4 博來(lái)霉素多次給藥肺組織膠原沉積的變化

與未處理組小鼠比較，處理組小鼠在初次給藥后0.5個(gè)月時(shí)出現(xiàn)藍(lán)綠色的膠原纖維，在繼續(xù)給藥1、2、4個(gè)月時(shí)膠原纖維持續(xù)存在（圖4，封四）。

2.5 博來(lái)霉素多次給藥對(duì)肺組織衰老細(xì)胞的影響

小鼠初次給藥4個(gè)月時(shí)肺組織冰凍切片進(jìn)行SAβ-Gal染色，衰老細(xì)胞胞漿為藍(lán)色。在BLM初次給藥4個(gè)月后，處理組小鼠冰凍切片中藍(lán)色細(xì)胞明顯比未處理組小鼠多，說(shuō)明處理組小鼠在4個(gè)月時(shí)肺組織中存在較多衰老細(xì)胞（圖5，封四）。

3 討論

BLM單次給藥肺纖維化模型易于操作，在闡明肺纖維化與細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子[6]信號(hào)通路上具有重要作用，如TGF-β在肺纖維化過(guò)程中的作用[14]。但該模型并沒(méi)有復(fù)制出人IPF進(jìn)展慢、不可逆這兩個(gè)重要特點(diǎn)[15]，且炎性反應(yīng)較為明顯[11]，利用此模型篩選出的200多種治療手段，在臨床轉(zhuǎn)化后沒(méi)有取得預(yù)期結(jié)果[8]，該模型需要進(jìn)一步優(yōu)化。

BLM多次給藥能造成小鼠肺持續(xù)性損傷，本研究觀察了BLM多次給藥造模過(guò)程中小鼠的動(dòng)態(tài)變化，與未處理組小鼠比較，處理組小鼠體重相對(duì)穩(wěn)定，肺局部反應(yīng)持續(xù)存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，多次給藥肺纖維化模型具有肺纖維化不可逆、炎性反應(yīng)明顯減弱等優(yōu)勢(shì)，多次給藥模型更接近臨床人類肺纖維化疾病的發(fā)展進(jìn)程。因此，我們希望能利用多次給藥模型進(jìn)行抗纖維化藥物篩選及藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為臨床有效治療肺纖維化提供更多的參考。

目前肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚不明確[16]，之前認(rèn)為是由慢性炎癥引起肺纖維化[17]，但抑制炎性反應(yīng)阻止肺纖維化的發(fā)展未取得預(yù)期效果。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞損傷在肺纖維化發(fā)生過(guò)程中起重要作用[18]，相比單次給藥，多次給藥模型小鼠炎性反應(yīng)減少且有明顯的肺泡上皮細(xì)胞增生[11，19]，這是多次給藥模型又一優(yōu)勢(shì)，在肺纖維化機(jī)制研究中具有重要意義，并能用于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肺重塑和修復(fù)的評(píng)估[11]。

關(guān)于BLM肺纖維化模型的機(jī)制，之前觀點(diǎn)是BLM誘導(dǎo)DNA斷裂產(chǎn)生自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]，引起細(xì)胞凋亡或壞死，產(chǎn)生炎性反應(yīng)和纖維化。Aoshiba等[20]認(rèn)為BLM誘導(dǎo)肺泡Ⅰ型細(xì)胞死亡，具有干細(xì)胞特性的肺泡Ⅱ型細(xì)胞增殖分化進(jìn)行修復(fù)，但BLM造成Ⅱ型細(xì)胞損傷，修復(fù)過(guò)程受阻，纖維母細(xì)胞被激活遷移到上皮細(xì)胞間缺陷處，從而導(dǎo)致肺纖維化。肺泡Ⅱ型細(xì)胞的損傷及過(guò)度增殖導(dǎo)致細(xì)胞衰老，可能是肺纖維化發(fā)生的一種新機(jī)制。SAβ-Gal染色結(jié)果也證明BLM處理組4個(gè)月的小鼠肺組織中出現(xiàn)細(xì)胞衰老的現(xiàn)象。通過(guò)清除衰老細(xì)胞是否可以治療肺纖維化疾病，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)，也許是肺纖維化疾病的一個(gè)新的治療方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Demedts M，Costabel U. ATS/ERS international multidisciplinary consensus classification of the idiopathic interstitial pneumonias [J]. EurRespir J，2002，19（5）：794-796.

[2] Huang X，Wang W，Yuan H，et al. Sunitinib，a Small-Molecule Kinase Inhibitor，Attenuates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Tohoku J Exp Med，2016， 239（4）：251-261.

[3] Moll S，Chaykovska L，Meier M，et al. Targeting the epithelial cells in fibrosis：a new concept for an old disease [J]. Drug Discov Today，2013，18（11/12）：582-591.

[4] Costabel U. Idiopathic pulmonary fibrosis in 2011：key updates on guidelines and therapeutics Concluding remarks [J]. Respiratory Research，2013，14 Suppl 1：S8.

[5] Latoche JD，Ufelle AC，F(xiàn)azzi F，et al. Secreted Phosphoprotein 1 and Sex-Specific Differences in Silica-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice [J]. Environ Health Perspect，2016，124（8）：1199-1207.

[6] Yilmaz O，Oztay F，Kayalar O. Dasatinib attenuated bleo-mycin-induced pulmonary fibrosis in mice [J]. Growth Factors，2015，33（5/6）：366-375.

[7] Latta VD，Cecchettini A，Ry SD，et al. Bleomycin in the setting of lung fibrosis induction：From biological mechanisms to counteractions [J]. Pharmacol Res，2015，97：122-130.

[8] Degryse AL，Lawson WE. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Med Sci，2011，341（6）：444-449.

[9] Chung MP，Monick MM，Hamzeh NY，et al. Role of repeated lung injury and genetic background in bleomycin-induced fibrosis [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29（3 Pt 1）：375-380.

[10] Moore BB，Hogaboam CM. Murine models of pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（2）：L152-160.

[11] Degryse AL，Tanjore H，Xu XC，et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，299（4）：L442-452.

[12] Moeller A，Ask K，Warburton D，et al. The bleomycin animal model：a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis？ [J]. Int J Biochem Cell Biol，2008，40（3）：362-382.

[13] Gelinas R，Chesler EJ，Vasconcelos D，et al. A genetic approach to the prediction of drug side effects：bleomycin induces concordant phenotypes in mice of the collaborative cross [J]. Pharmgenomics Pers Med，2011，4：35-45.

[14] Goodwin A，Jenkins G. Role of integrin-mediated TGFbeta activation in the pathogenesis of pulmonary fibrosis [J]. Biochem Soc Trans，2009，37（4）：849-854.

[15] Chua F，Gauldie J，Laurent GJ. Pulmonary fibrosis：searching for model answers [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33（1）：9-13.

[16] Andrade-Sousa AS，Rogerio Pereira P，MacKenzie B，et al. Aerobic Exercise Attenuated Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Th2-Dominant Mice [J]. PLoS One，2016，11（9）：e0163420.

[17] Kropski JA，Lawson WE，Young LR，et al. Genetic studies provide clues on the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Dis Model Mech，2013，6（1）：9-17.

[18] Loomis-King H，F(xiàn)laherty KR，Moore BB. Pathogenesis，current treatments and future directions for idiopathic pulmonary fibrosis [J]. Curr Opin Pharmacol，2013，13（3）：377-385.

[19] Lee SH，Lee EJ，Lee SY，et al. The effect of adipose stem cell therapy on pulmonary fibrosis induced by repetitive intratracheal bleomycin in mice [J]. Exp Lung Res，2014， 40（3）：117-125.

[20] Aoshiba K，Tsuji T，Nagai A. Bleomycin induces cellular senescence in alveolar epithelial cells [J]. Eur Respir J，2003，22（3）：436-443.

（收稿日期：2016-10-13 本文編輯：張瑜杰）