孫鳳姣，張譯丹，張密霞，莊朋偉，張艷軍

(天津中醫(yī)藥大學，天津市中藥藥理重點實驗室，天津 300193)

β-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號通路在阿霉素誘導大鼠心肌細胞凋亡中的作用

孫鳳姣，張譯丹，張密霞，莊朋偉，張艷軍

(天津中醫(yī)藥大學，天津市中藥藥理重點實驗室，天津 300193)

阿霉素；心臟毒性；β腎上腺素受體；不同時期；心功能；凋亡

阿霉素(Adriamycin，ADR)是一種顯效的廣譜蒽環(huán)類化療藥物[1]，其抗腫瘤治療同時產(chǎn)生的急性和慢性心臟毒性效應[2]，在一定程度上限制了其臨床應用。研究表明，ADR急性暴露期造成的心臟毒性表現(xiàn)為可逆性心肌收縮功能障礙，心臟明顯萎縮，并伴隨較輕心肌纖維化和凋亡。ADR撤離后的恢復期，盡管心臟收縮功能有所恢復，心肌細胞凋亡率和纖維化程度卻不斷升高[1，3]。β-腎上腺素受體(β-adrenoceptor，β-AR)作為重要的G蛋白偶聯(lián)受體，具有下游通路的多向調(diào)控作用，其在心臟功能障礙、心臟重塑、心肌細胞凋亡、心衰的發(fā)展進程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[4-5]。研究顯示[4，6-7]，β-AR的持續(xù)刺激引起β-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號通路的激活，從而促進心肌細胞凋亡等改變，進一步加速心衰的進程。在ADR造成心肌細胞不可逆損傷并最終導致心衰的動態(tài)過程中，β-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號是否參與了ADR導致心肌凋亡未見報道。因此，本研究通過注射ADR觀察心肌組織β-AR、PKA和CaMK Ⅱ蛋白表達的變化與心肌細胞凋亡變化的關(guān)系，擬從分子角度探討ADR誘導心肌細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 70只SPF級♂ Sprague Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(250±10)g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所(天津)，許可證號：SCXK-(軍)2014-0001。

1.2 主要藥品試劑和儀器 鹽酸ADR(Adriamycin hydrochloride/ Adriamycin)，批號：P1141635，購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；超高分辨率小動物超聲實時影像系統(tǒng)，VisualSonics Vevo@2100維勝(中國)有限公司；德國Sigma 3K15高速(冷凍)離心機；BNP ELISA試劑盒，批號：L09032840，cTn-T ELISA試劑盒，批號：L09032841，均購自武漢華美生物工程有限公司(CUSABIO)；Masson三色染色試劑盒，批號：20150908，北京索萊寶科技有限公司(Solarbio)；原位細胞凋亡POD標記(TUNEL)檢測試劑盒，批號：10768100，德國羅氏公司(Roche)；瑞士Tecan Infinite M200 Pro多功能酶標儀；德國Leica DM4000B LED熒光顯微鏡；抗tubulin抗體購自Santa Cruz(SC-91C4)；抗β1-AR、抗β2-AR抗體均購自Abcam(ab3442，ab137494)；抗PKA抗體購自Millipore(#06-903)；抗CaMK Ⅱ抗體購自Cell Signaling Technology(#3362)；羊抗兔IgG-HRP二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物模型建立及分組 70只SD ♂ 大鼠隨機分為兩組：對照組(CON，n=30)和阿霉素組(ADR，n=40)。ADR組參照文獻方法[8-10]構(gòu)建大鼠心肌損傷模型：ADR粉末用無菌生理鹽水配制成1 g·L-1溶液，每3 d腹腔注射1次ADR(3 mg·kg-1)，連續(xù)5次，累積總量為15 mg·kg-1，于兩周內(nèi)注射完成。CON組注射等量生理鹽水。分別于實驗第2、4和6周動態(tài)監(jiān)測一般狀況和心功能，并獲取血清和心臟組織進行心衰標志物、病理學指標以及β-AR通路信號分子測定。

1.4 超聲心動圖 對大鼠進行超聲心動圖檢測，動態(tài)觀察心臟功能及結(jié)構(gòu)的變化。采用Vevo@2100小動物超聲儀，MS250線陣探頭，探頭頻率為21 MHz。大鼠吸入3%～4%異氟烷誘導麻醉后，刮去胸前體毛，仰臥位固定于37℃恒溫加熱板上，1%～2%異氟烷維持麻醉，獲取胸骨旁左心室乳頭肌水平長軸M型圖像，求3個心動周期的平均值，并計算左心室質(zhì)量(left ventricular Mass, LV mass)=1.04×[(LVIDd+LVPWd+IVSd)3-LVIDd3]-13.6，計算左心室射血分數(shù)(ejection fraction, EF%)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%和每搏輸出量(stroke volume,SV)=LVEDV-LVESV。

1.5 血清BNP和cTn-T水平測定 腹主動脈取血液標本，冷凍高速離心機3 000 r·min-1離心10 min，-80℃冰箱保存。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清中BNP和cTn-T濃度，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.6 心臟組織切片及染色 大鼠行腹主動脈取血后立即處死，取出心臟，用生理鹽水沖洗殘血。4%的中性多聚甲醛固定，在相當于左心室橫切面乳頭肌水平切取環(huán)形心肌標本，常規(guī)石蠟包埋固定切片，進行HE染色后觀察其組織病理性損傷改變。Masson染色后在400倍顯微鏡下隨機攝取左心室區(qū)8個視野，Image J圖像軟件分析膠原纖維面積，膠原容積/%= 膠原面積/總面積。采用原位細胞凋亡POD標記法檢測各組心肌組織中的凋亡細胞數(shù)，嚴格按照Roche公司說明書進行操作。在400倍顯微鏡下隨機攝取左心室區(qū)8個視野，計算TUNEL陽性細胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測 12 000×g離心5 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量，并將各組單位體積所含總蛋白含量調(diào)整至同一水平?？偟鞍捉?jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(β1-AR、β2-AR、PKA、CaMK Ⅱ，均1 ∶1 000稀釋；tubulin 1 ∶500稀釋)孵育過夜后，TBST清洗并加入二抗(兔IgG，1 ∶5 000)孵育。ECL發(fā)光試劑顯色后，自動凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 ADR組在ADR注射期間大鼠出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、活動減少、毛發(fā)脫落、生長緩慢等現(xiàn)象；ADR組大鼠體質(zhì)量明顯低于CON組。注射完成后ADR組大鼠體質(zhì)量開始增長，但仍低于CON組，見Tab 1。4周和6周取材時觀察到ADR組大鼠的肝臟邊緣圓鈍、腹腔大量腹水，個別大鼠出現(xiàn)血性腹水；正常對照組則無此類現(xiàn)象。

GroupBodyweight/g0wk2wk4wk6wkCON262.17±9.77349.27±21.50361.20±43.45372.29±35.77ADR266.63±13.12256.82±43.57**298.53±53.23**322.29±54.73

**P<0.01vsCON group

2.2 超聲心動圖評價大鼠心功能改變 Tab 2所示，ADR末次注射后，即第2周時，ADR組大鼠EF、SV、LV Mass明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；停止ADR干預后，ADR組觀察到EF、SV與第2周比存在回升趨勢，但始終低于CON組。與CON組比，SV在6周時明顯下降。4周和6周時，LV Mass與CON組比較無差異。

Time/wkGroupEF/%LVMass/gSV/μL2CON(n=10)79.8±7.50.81±0.13212.7±49.4ADR(n=10)63.3±18.4*0.59±0.15**128.5±38.8**4CON(n=10)76.5±9.40.78±0.15182.9±37.5ADR(n=10)69.7±10.30.82±0.19157.0±32.86CON(n=10)76.3±4.10.66±0.14195.6±44.4ADR(n=6)69.6±12.90.59±0.09154.8±23.8*

EF:ejection fraction;LV Mass:left ventricular mass;SV:stroke volume.*P<0.05,**P<0.01vsCON group

2.3 血清BNP和cTn-T水平的測定 Tab 3所示，ADR組BNP和cTn-T從第2周開始明顯上升，第4周和第6周均繼續(xù)升高。

2.4 心肌組織病理學改變 HE染色低倍鏡觀察可見Fig 1，與CON組比較，第2周時ADR組大鼠心臟體積變小，左室壁明顯變薄，第4和第6周，心臟體積和左室壁厚度又恢復正常水平，見Fig 1A～1D。高倍鏡下可觀察到正常心肌組織肌纖維排列整齊。ADR組第2周時心肌細胞出現(xiàn)萎縮，第4周時，廣泛心肌細胞胞質(zhì)稀疏，炎細胞浸潤，可見心肌細胞空泡樣變，且隨著時間延長到第6周時，病變進一步加重，見Fig 1E～1H。Masson染色顯色，心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，見Fig 2A～2D。與CON組比，ADR組膠原纖維第2周明顯增加，且隨著時間延長到第4和6周，膠原纖維沉積更多。TUNEL染色結(jié)果顯色，棕色為陽性細胞，藍色為細胞核，見Fig 2F～2I。與CON組比較，ADR組第2周心肌組織可見心肌細胞凋亡率明顯增加，且隨著時間延長到第4和6周細胞凋亡率更高。

2.5 β腎上腺素受體表達 Fig 3所示，ADR組β1-AR表達從第2周開始明顯下降，第4和6周繼續(xù)下降，β2-AR表達水平無明顯變化。PKA、CaMK Ⅱ蛋白表達第2周時明顯下降，第4周和第6周時逐漸上升。

GroupTimenBNP/μg·L-1cTn-T/ng·L-1CON100.75±0.2375.4±24.7ADR2wk101.16±0.43*130.8±49.9*4wk71.24±0.45**165.9±62.6**6wk61.39±0.49**149.3±57.3**

BNP:brain natriuretic peptide;cTn-T:cardiac troponin-T.*P<0.05,**P<0.01vsCON group

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADR累積注射暴露期的急性心臟毒性與停藥后的恢復期的慢性心臟毒性存在不同表征和機制。第2周時(急性期)，ADR可以通過誘導β1-AR及其下游分子PKA表達降低而導致心功能明顯降低，并伴隨CaMK Ⅱ蛋白表達的降低，心肌細胞明顯萎縮，并伴隨較輕的心肌纖維化和凋亡率。第4周時(恢復期)，β1-AR表達進一步降低，β2-AR-cAMP-PKA信號激活引起心功能部分恢復[11-12]，并且伴隨CaMK Ⅱ表達增加，心肌細胞纖維化加重，凋亡率升高。且隨著時間延長(第6周時)，PKA、CaMK Ⅱ蛋白表達進一步增加，心肌凋亡繼續(xù)升高，心室病理重塑加重。結(jié)果提示，ADR導致的心功能障礙、心肌重塑和凋亡動態(tài)改變過程可能與β-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號通路改變有關(guān)。

Fig 1 Effects of ADR on pathological changes in heart tissues by HE staining(HE×12.5,A～D;HE×400,E～H)

A:CON group;B:ADR 2 wk group;C:ADR 4 wk group;D:ADR 6 wk group;E:CON group;F:ADR 2 wk group;G:ADR 4 wk group;H:ADR 6 wk group

Fig 2 Effects of ADR on collagen content and apoptosis in rats by Masson and TUNEL staining(Masson×400,A～D;TUNEL×400, F～I)

A: CON group; B: ADR 2 wk group; C: ADR 4 wk group; D: ADR 6 wk group; E: Quantitation of collagen volume fraction; F: CON group; G: ADR 2 wk group; H: ADR 4 wk group; I: ADR 6 wk group; J: TUNEL-positive cells ratio.*P<0.05,**P<0.01vsCON group

β-AR亞型可通過不同信號通路調(diào)控心肌收縮功能和心室重構(gòu)[4-5]。正常心肌以β1-AR為主，其與β2-AR數(shù)量之比約為75% ∶20%，兒茶酚胺主要通過刺激β1-Gs-adenylyl cyclase(AC)-cAMP-PKA信號通路來發(fā)揮正性肌力作用；而β1-AR的持續(xù)刺激會進一步引起下游CaMKⅡ的過度表達，促進心肌細胞凋亡，加速心衰表型[4,6-7]。心力衰竭時，兒茶酚胺作用于β2亞型受體引起的效應發(fā)揮主導調(diào)節(jié)作用，這可能與β1-AR下調(diào)(β1由正常的75%左右下降至約50%)以及β2-AR重新分布改變胞內(nèi)cAMP信號的傳播有關(guān)。生理狀態(tài)下，β1-AR激活產(chǎn)生的cAMP信號彌散分布于整個胞質(zhì)，β2-AR激活后cAMP信號只局限于受體周圍。在發(fā)生衰竭的心肌細胞內(nèi)，部分T管區(qū)β2-AR可能重分布于細胞脊區(qū)，且PKA對β2-cAMP信號的限制作用減弱，β2激活產(chǎn)生的效應與β1-AR類似[11-12]。這些改變可能會促進β-AR信號通路激活引起的心肌毒性作用，加重心衰表型。

β-AR亞型信號通路的多向調(diào)控在ADR誘導心臟功能損傷和結(jié)構(gòu)重塑的動態(tài)改變過程中起重要調(diào)控作用。第2周時，心功能明顯下降，心肌萎縮，血清BNP和cTn-T升高，較輕的心肌細胞凋亡率和纖維化對心功能減弱影響相對較小[3]；而心功能障礙的機制可能與β1-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號下調(diào)有關(guān)。與之相比，第4周時心功能在一定程度上有所恢復，但是血清BNP和cTn-T濃度進一步升高，心肌細胞凋亡率和纖維化程度大量增加，結(jié)果與文獻報道一致[13]。這種病理重塑和凋亡加重可能與β-AR信號傳導通路的改變有關(guān)。隨著心衰的發(fā)生發(fā)展(第4周時)，β2-AR對兒茶酚胺的反應性增強，產(chǎn)生與β1-AR類似的效應。β2-AR-Gs-PKA信號激活，一方面增強心肌收縮力，另一方面促進其下游信號分子CaMK Ⅱ蛋白表達升高，誘導心肌細胞凋亡[11-12]而發(fā)揮毒害作用。隨著時間的延長(第6周時)，β-AR信號引起的不利影響更占主導作用，心肌細胞凋亡率繼續(xù)升高，加重心肌病理重塑，促進心衰的發(fā)生發(fā)展。

Fig 3 Expression of β1-AR, β2-AR, PKA and CaMK Ⅱ proteins in left ventricular by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;#P<0.05,##P<0.01vsADR 2 wk group

本實驗結(jié)果表明，ADR連續(xù)注射導致的急性心臟毒性表現(xiàn)為心臟收縮功能障礙，心肌萎縮，并伴隨較輕心肌纖維化和凋亡；慢性恢復期心臟毒性表現(xiàn)為心功能有所恢復，但心肌纖維化程度和凋亡率不斷升高，且隨著時間延長，凋亡率不斷增加。ADR注射大鼠急性期心肌PKA和CaMK Ⅱ蛋白表達均下調(diào)，而恢復期這兩種蛋白表達均上調(diào)，提示ADR導致的心功能障礙、心肌重塑和凋亡動態(tài)改變過程可能與β-AR/PKA/CaMK Ⅱ信號通路改變有關(guān)。

(致謝：本實驗主要在天津中醫(yī)藥大學天津市中藥藥理重點實驗室完成，在此特別感謝參與本實驗的所有老師和同學。)

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Roles of β-AR/PKA/CaMK Ⅱ signaling pathway in cardiomyocyte apoptosis induced by adriamycin in rats

SUN Feng-jiao, ZHANG Yi-dan, ZHANG Mi-xia, ZHUANG Peng-wei, ZHANG Yan-jun

(TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,TianjinKeyLaboratoryofPharmacologyofChineseMateriaMedica,Tianjin300193,China)

Aim To research the molecular mechanisms of adriamycin-induced cardiomyocyte apoptosis based on β-adrenoceptor signaling pathway during development of heart failure.Methods Seventy male SD rats were assigned randomly into two groups: the control group(CON,n=30) and the ADR-induced cardiotoxicity group(ADR,n=40). ADR was administered intraperitoneally in five equal injections(each containing 3 mg·kg-1) over a period of two weeks, with a total cumulative dose of 15 mg·kg-1body weight. Age-matched rats injected with saline were used as controls.The general condition of all rats was observed, and transthoracic echocardiography was performed immediately following the final ADR injection, and then every other week. Serum and myocardial tissue were harvested at W2, W4 and W6 separately. The serum contents of brain natriuretic peptide(BNP) and cardiac troponin-T(cTn-T) were analyzed by euzymelinked immunosorbent assay(ELISA).The pathological change and apoptosis were determined by HE, Masson and terminal deoxyribonucleotide transferase-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The protein expressions of β1-AR, β2-AR, PKA and CaMK Ⅱ were detected by Western blot.Results Following the final ADR injection, cardiac systolic function and SV declined, which was accompanied by marked atrophy of the heart, low levels of cardiomyocyte fibrosis and apoptosis, significantly increased serum BNP and cTn-T and decreased β1-AR，PKA and CaMK Ⅱ protein expression. However, cardiac systolic function was improved with the extension of time but remained depressed as compared to CON group. The serum BNP and cTn-T concentration kept on rising. The gradual aggravation apoptosis and concomitant fibrosis in the ADR group heart were observed following ADR withdrawal. β1-AR protein expression was continuously down-regulated, β2-AR protein expression unchanged. Expression of PKA and CaMK Ⅱ proteins in hearts from ADR-injected rats gradually increased.Conclusion β-AR/PKA/CaMK Ⅱ signaling pathway mediates cardiomyocyte apoptosis during the progress of ADR-induced cardiac dysfunction and pathological remodeling and apoptosis.

adriamycin; cardiotoxicity; β-adrenoceptor; different stages; cardiac function; apoptosis

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.028.html

2016-09-14,

2016-12-05

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(No 2011CB505300, 2011CB505302)

孫鳳姣(1988-)，女，博士生，研究方向：中藥藥理學，E-mail:sunfengjiao.ya@163.com； 張艷軍(1967-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥毒理學及配伍禁忌，通訊作者，E-mail:zyjsunye@163.com； 莊朋偉(1982-)，男，博士，副教授，通訊作者，E-mail:zhuangpengwei@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.014

A

1001-1978(2017)03-0360-06

R-332；R322.11；R329.25；R331.31；R392.11；R979.14摘要：目的 基于β腎上腺素受體信號通路探討阿霉素誘導心衰發(fā)展過程中心肌細胞凋亡的分子生物學機制。方法 SD大鼠70只，隨機分為對照組(CON組，n=30)和阿霉素組(ADR組，n=40)。ADR組腹腔注射阿霉素，每次3 mg·kg-1，連續(xù)兩周內(nèi)每隔兩天注射1次，共注射5次，累積總量為15 mg·kg-1。于實驗第2、4和6周分別觀察實驗大鼠一般狀況和心功能，并取血清，ELISA法測定血清BNP和cTn-T濃度。取心臟組織，HE、Masson和TUNEL染色觀察病理形態(tài)學改變和凋亡，Western blot法檢測β1-AR、β2-AR、PKA、CaMKⅡ等蛋白表達的變化。結(jié)果 阿霉素注射完成后，ADR組EF和SV明顯降低，血清BNP和cTn-T明顯高于CON組，心臟明顯萎縮，并伴隨較輕心肌纖維化和凋亡，β1-AR、PKA、CaMKⅡ蛋白表達均降低。隨著時間的延長，心臟收縮功能有所恢復，但BNP和cTn-T繼續(xù)升高，心肌纖維化和凋亡嚴重，β1-AR表達進一步降低，β2-AR表達未見明顯變化，PKA、CaMK Ⅱ表達逐漸升高。結(jié)論 阿霉素誘導的心功能障礙、心肌重塑和凋亡動態(tài)改變過程可能與β-AR/PKA/CaMKⅡ信號通路變化有關(guān)。