宋成攀+孟娟+夏松波+王孝剛+張教海+張友昌+別墅

摘要：利用iTRAQ技術(shù)從陸地棉（Gossypium hirsutum L.）HM-40中篩選并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶GhSAMS基因。GhSAMS基因的開放閱讀框全長為1 182 bp，編碼393個氨基酸，預測GhSAMS蛋白質(zhì)含有15個磷酸化位點，推測其功能的行使可能與激酶磷酸化相關(guān)，進化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶與茶樹（Camellia sinensis）的SAMS蛋白質(zhì)相似性最高。qRT-PCR分析表明，在接種黃萎病菌VD07菌系后，GhSAMS表達量逐漸增加，隨著接種時間的延長，其相對表達量隨之增加，推測其在陸地棉抗黃萎病防衛(wèi)反應中可能起重要作用。在嫁接棉株中，利用VIGS技術(shù)成功地沉默GhSAMS基因，然后對沉默棉株接種黃萎病菌VD07，鑒定其病情指數(shù)為62.5，抗性級別為感病；而轉(zhuǎn)化空載體和未接種載體處理的嫁接棉株病情指數(shù)分別為30.0和31.2，抗性級別為耐病，表明GhSAMS基因沉默后嫁接棉對黃萎病的抗性喪失。推測GhSAMS基因在陸地棉抗黃萎病的過程中可能起重要作用。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum L.）嫁接；S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因；黃萎??；VIGS

中圖分類號：S562 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6261-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.065

Abstract：The GhSAMS gene was cloned from cotton（Gossypium hirsutum L.） cultivar HM-40， which was selected by iTRAQ of sea-land grafting cotton. The GhSAMS open reading frame（ORF） was 1 182 bp and encoded a protein of 393 amino acids. Many Phosphorylation sites were found in GhSAMS protein， which suggested that the function of GhSAMS is related to phosphorylation of these sites. The cloned gene was most closely related to Camellia sinensis CHS protein by phylogenetic analysis. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction showed that GhSAMS gene was rapidly activated after inoculation with Verticillium dahliae. When time prolonged，the expression of related genes always inc reased. It was assumed that the GhSAMS gene might play an important role in the defense reaction against Verticillium wilt. Virus induced gene silencing was used to silence endogenous genes in resistant upland cotton by sea-land grafting cotton targeting a fragment of GhSAMS. VD07 was used to inoculate silenced cotton plants to identify disease resistance. The results showed that the disease indices of wild type vector control and sea-land grafting cotton plants were 30.0 and 31.2，respectively. The disease index of silenced GhSAMS plants was 62.5. These results confirmed that the GhSAMS gene might relate to Verticillium wilt resistance in cotton.

Key words：cotton（Gossypium hirsutum L.） grafting；GhSAMS gene；Verticillium wilt；VIGS

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）是生物合成乙烯和多胺等物質(zhì)的關(guān)鍵酶[1]，主要參與了植物代謝中轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基等多種生化反應，并且能催化L-甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸[2，3]。因此，對S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的研究在植物抗逆反應，尤其是抗病蟲害等方面的研究具有重要的意義。陸地棉（Gossypium hirsutum L.）的生產(chǎn)長期遭受黃萎?。╒erticillium wilt）的侵襲[4]，目前為了進一步提高棉花對黃萎病的抗性，棉花黃萎病抗病性的分子機理研究倍受重視。

目前，陸地棉的抗黃萎病研究主要有四個方面，生理生化特性、克隆抗病相關(guān)基因、鑒定抗病相關(guān)蛋白和表觀遺傳學。通過對不同嫁接方式的棉花接種黃萎病后進行生理生化特性的研究，發(fā)現(xiàn)嫁接能夠提升棉花的黃萎病抗病性[5]。利用基因步移等方法克隆出了GhSKIP35基因，推測其參與了棉花早期抗病信號的傳遞途徑[6]。采用RNA-seq測序技術(shù)鑒定出Dirigent-like蛋白在不同抗性棉花品種中的表達變化，發(fā)現(xiàn)其與黃萎病菌侵入后棉花植株的抗性反應相關(guān)[7]。本研究利用iTraQ技術(shù)篩選在抗黃萎病過程中可能起作用的蛋白質(zhì)，然后克隆得到其相應基因完整的ORF區(qū)序列，對其進行相關(guān)生物信息學分析和接種黃萎病菌后的表達分析，另外利用VIGS技術(shù)沉默這個基因，然后調(diào)查了沉默棉花的抗病指數(shù)，以期為更深入地研究其功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

陸地棉感病品種HM-40，海島棉高抗品種海7124，由武漢大學生命科學院實驗室鑒定保存，于兩片1元硬幣大小的真葉時期嫁接處理，海島棉為砧木，陸地棉為接穗。嫁接成活后7 d接強力致病菌VD07（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所朱荷琴提供），每株接菌20 mL，濃度為107個/mL，分別取0、2、4、6、8、10 d的棉花真葉，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待用。

VIGS研究在嫁接成活后7 d 進行，方法參照Gao等[8]轉(zhuǎn)化棉花的技術(shù)方法，分別注射接種農(nóng)桿菌pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhSAMS-pYL-192，在16 d后取嫁接棉真葉，液氮冷凍后保存于 -80 ℃冰箱待用。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化16 d后接大麗輪枝菌VD07，每株接菌20 mL，濃度為107個/mL，并在接種25 d后調(diào)查病情指數(shù)。

DP441植物RNA快速提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T載體購自TAKARA（大連）生物科技有限公司；OMEGA E.Z.N.A.？誖Cycle Pure Kit純化試劑盒、EsTaq mix、大腸桿菌感受態(tài)top 10購自武漢歐瑞文生物科技有限公司；kod plus neo高保真聚合酶購自Toyobo（上海）生物科技有限公司；GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)實驗室自制，煙草脆裂病毒沉默載體pYL-192、pYL-156由清華大學劉玉樂教授饋贈。

1.2 總RNA提取及cDNA制備

采用天根DP441試劑盒提取總RNA，然后用TAKARA PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

1.3 GhSAMS基因的克隆

采用Oligo 7軟件設計引物。以GhSAMS-F（5′AAAACAGCAGAGAAATTAAGGA 3′）和GhSAMS-R（5′ GAAGAAGCTCCAATTAAGCA 3′）為引物，用kod plus neo進行基因擴增。PCR程序為94 ℃預變性，5 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；繼續(xù)延伸68 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖水平凝膠中電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化使用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒，嚴格按照說明進行操作。然后采用pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞top 10，倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，進行菌液PCR檢測，并且測序進行驗證。測序由蘇州金唯智科技有限公司完成。

1.4 GhSAMS基因的VIGS載體的構(gòu)建

設計VIGS引物，以pYL-156-SAMS-F（5′ CCGGAATTCAAAACAGCAGAGAAATTAAGGA 3′）和pYL-156-SAMS-R（5′CCGCTCGAGGAAGAAG- CTCCAATTAAGCA 3′）為引物（下劃線部分為保護堿基和酶切位點），用LA Taq進行基因擴增。PCR程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；后延伸72 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖水平凝膠中電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化使用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒，嚴格按照說明進行操作。然后進行酶切反應，同樣酶切pYL-156質(zhì)粒，solutionⅠ連接4 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞top 10，倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，進行菌液PCR檢測，并且測序進行驗證。測序由蘇州金唯智科技有限公司完成。

提取陽性質(zhì)粒，用農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101電轉(zhuǎn)，涂平板后28 ℃倒置暗培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，進行菌液PCR檢測。挑取陽性的農(nóng)桿菌克隆，分別為pYL-156-GhSAMS[8]。

1.5 克隆序列的生物信息學分析

使用在線軟件Protparam和PSORT分析這兩個蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)并進行亞細胞定位的預測。采用SignalP 4.1分析蛋白質(zhì)是否含有信號肽。采用TMHMM預測跨膜螺旋。然后在NCBI上的Protein blast進行氨基酸同源序列比對，用DANMAN進行氨基酸同源性分析，用MEGA 5軟件對其他植物GhSAMS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。應用NetPhos 2.0程序預測磷酸化位點[9]。

1.6 GhSAMS基因表達模式分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，采用qRT-PCR 分析GhSAMS基因的相對表達量。擴增目標基因引物為qSAMS-F（5′TGATACTTATGGAGGATGGG3′） 和qSAMS-R（5′ATGGCGTAGGAGACTTGC3′）；內(nèi)參基因引物為actin-F（5′TCACGGAAGCACCTCTCAAC 3′）和actin-R（5′ACAAAGAGAGAACGGCCTGG 3′），每個樣品3次技術(shù)重復和3次生物學重復，使用Bio-Rad CFX96 Manager熒光定量儀進行分析，按照2^-ΔΔCt法計算相對表達量。qRT-PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火延伸20 s，40個循環(huán)；65～95 ℃，每步增加0.5 ℃，5 s做溶解曲線以確定擴增產(chǎn)物的特異性，延伸5 s。

1.7 GhSAMS基因的功能半定量和qRT-PCR 分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA原液稀釋10倍，采用引物V-qSAMS-F（5′ AGCCATTGTCTGTATTTG 3′）和V-qSAMS-R（5′ CTCATTGCTATTTCATTC 3′），內(nèi)參基因引物為actinB-F（5′ GTTATGGTTGGGATGGG 3′）和actinB-R（5′ CAAGGTCAAGACGGAGG 3′）進行半定量分析，PCR程序為94 ℃預變性，5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，分別進行20、25、28、31、32、33、34、35、36、37、38個循環(huán)；延伸72 ℃，10 min，4 ℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖水平凝膠中電泳檢測。

采用qRT-PCR 分析GhSAMS基因的相對表達量。擴增目標基因引物為qvGhSAMS-F：（5′ GTTTATCTTATCTGCTGTC 3′）和qvGhSAMS-R（5′ CTC- ATTGCTATTTCATTC 3′）；內(nèi)參基因引物為actin-F（5′ TCACGGAAGCACCTCTCAAC 3′）和actin-R（5′ ACAAAGAGAGAACGGCCTGG 3′），qPCR方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉基因GhSAMS的克隆

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以GhSAMS-F和GhSAMS-R為引物，獲得了1 217 bp的陽性條帶（圖1），測序結(jié)果見圖2。由圖2可知，ORF全長為1 182 bp。

2.2 GhSAMS蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

將GhSAMS蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入分析軟件Protparam，該蛋白質(zhì)的分子式為C1 903H3 001N525O583 S15，其等電點約為5.65，分子量43.044 kD，氨基酸數(shù)目結(jié)果見表1，使用頻率較高的氨基酸有Lys、Val、Ala、Gly、Thr、Asp，呈負電荷的酸性氨基酸（Glu和Asp）共56個，呈正電荷的堿性氨基酸（Lys和Arg）共45個，表明該蛋白質(zhì)帶負電且呈酸性。預測其不穩(wěn)定指數(shù)為21.76，在體外的哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中表達時半衰期約30 h，在酵母中表達時半衰期超過20 h，在大腸桿菌中表達時半衰期超過10 h，蛋白質(zhì)表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.3 GhSAMS蛋白質(zhì)的親疏水性和亞細胞定位預測

使用蛋白質(zhì)的親疏水性預測在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）將GhSAMS蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入，分析結(jié)果見圖3。GhSAMS蛋白質(zhì)的親水性平均系數(shù)（GRAVY）是-0.300，表明整個蛋白質(zhì)呈親水性。再將GhSAMS蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入到在線分析軟件PSORT中進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示GhCHS蛋白質(zhì)可能定位于細胞質(zhì)（得分0.450）、過氧化物酶體（得分0.437）、溶酶體（得分0.100）和線粒體基質(zhì)（得分0.100）；使用SignalP 4.1分析GhSAMS蛋白質(zhì)有無信號肽序列，結(jié)果顯示GhSAMS蛋白質(zhì)無信號肽序列，那么該蛋白質(zhì)無法進行跨膜運輸；使用TMHMM預測該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)沒有跨膜螺旋區(qū)。根據(jù)以上的預測，推斷GhSAMS蛋白質(zhì)是一種親水性細胞質(zhì)蛋白質(zhì)。

2.4 GhSAMS蛋白質(zhì)的同源比對和系統(tǒng)進化樹分析

用BlastP進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉 GhSAMS的氨基酸序列與其他物種的該蛋白質(zhì)具有很高的同源性。選取10個代表性物種，如木豆（Cajanus cajan，AEY85025.1）、茶樹（Camellia sinensis，AHB32111.1）、棕櫚（Elaeis guineensis，XP_010921340.1）、野生大豆（Glycine soja，KHN28175.1）、番薯（Ipomoea batatas，ABP35525.1）、苜蓿（Medicago sativa，AAT40304.1）、桃樹（Prunus persica，AGF95108.1）、白梨X（Pyrus X bretschneideri，AJF23500.1）、刺槐（Robinia pseudoacacia，AIT39705.1）和杯萼海桑（Sonneratia alba，AGJ71754.1），采用DNAMAN軟件進行同源序列比對，結(jié)果如圖4所示，氨基酸序列具有很高的相似性。使用MEGA 5.0軟件建構(gòu)蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖5所示，陸地棉的GhSAMS蛋白質(zhì)與茶樹的AHB32111.1進化關(guān)系最近。

2.5 GhSAMS蛋白質(zhì)的磷酸化位點預測

磷酸化是蛋白質(zhì)修飾的一種方式，參與并調(diào)控著許多細胞活動，在真核生命活動中有著重要意義，蛋白質(zhì)磷酸化修飾后，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性、活性以及在細胞中所處的位置[10]。GhSAMS蛋白質(zhì)含有30個蘇氨酸和16個絲氨酸，潛在的磷酸化位點較多。運用蛋白質(zhì)磷酸化位點預測在線軟件NetPhos 2.0進行分析，預測結(jié)果見圖6。GhCHS蛋白質(zhì)潛在蘇氨酸（Thr）磷酸化位點有6個，潛在絲氨酸（Ser）磷酸化位點有6個，潛在酪氨酸（Tyr）磷酸化位點有3個。預測GhSAMS蛋白質(zhì)磷酸化位點共15個，GhSAMS蛋白質(zhì)的功能與激酶磷酸化相關(guān)。

2.6 GhSAMS基因在黃萎病菌脅迫下的相對表達量

利用qRT-PCR方法分析GhSAMS基因在嫁接棉（海7124為砧木，HM-40為接穗）真葉中的相對表達量。結(jié)果顯示（圖7），GhSAMS基因在接種大麗輪枝菌VDO7菌株初期，基因表達量增加，隨著接菌處理時間的延長，相對表達量逐漸增加，且2、4、6、8、10 d與未接菌時相比差異顯著（P<0.05），在接種10 d時，該基因的表達量上調(diào)了約28倍，推測其在嫁接棉抗黃萎病防衛(wèi)反應中可能起重要作用。

2.7 利用VIGS技術(shù)研究GhSAMS基因的功能

在接種農(nóng)桿菌16 d后分別取接種空載體pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhSAMS-pYL-192的棉花葉樣品提取總RNA，進行RT-PCR分析，然后進行半定量試驗（圖8）和qRT-PCR試驗，發(fā)現(xiàn)接種帶目的基因載體的比接種帶空載體的基因表達量分別下降91.85%（圖9）。對未接農(nóng)桿菌處理嫁接棉、轉(zhuǎn)化空載體嫁接棉和基因沉默嫁接棉接種大麗輪枝菌后25 d進行調(diào)查，結(jié)果表明，未接農(nóng)桿菌嫁接棉病情指數(shù)為31.2，表現(xiàn)為耐??；轉(zhuǎn)化空載體嫁接棉病情指數(shù)為30.0，表現(xiàn)為耐?。换虺聊藿用薏∏橹笖?shù)分別為62.5，表現(xiàn)為感?。▓D10）。

3 討論

20世紀生命科學領域持續(xù)飛速發(fā)展，越來越多新的技術(shù)被開發(fā)出來，并且與計算機學科交叉結(jié)合起來產(chǎn)生了生物信息學這門全新的學科，科研工作者不斷有新的發(fā)現(xiàn)和重大突破。在植物基因工程研究方面，大量的基因被克隆出來，進而深入的研究其功能，尤其是VIGS（Virus induced gene silencing）技術(shù)的開發(fā)與應用，在研究植物基因功能時，不再必須獲得RNAi的轉(zhuǎn)基因純合植株，通過VIGS技術(shù)即可快速沉默相關(guān)基因，無疑加速了研究基因的功能[11]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物合成乙烯和多胺等物質(zhì)過程中的關(guān)鍵酶，還能合成S-腺苷甲硫氨酸，植物代謝過程中許多生長發(fā)育、抗逆反應相關(guān)的次生代謝物質(zhì)的生成均與這些途徑密不可分，大量研究證實他與乙烯和多胺的合成相關(guān)，這些物質(zhì)都與植物的抗逆防御反應有直接關(guān)系[1，12，13]。雖然對棉花抗黃萎病相關(guān)基因的研究較多，但是目前關(guān)于S-腺苷甲硫氨酸合成酶在棉花抗黃萎病的研究上還較少，值得深入研究，也能進一步了解這類基因在植物細胞中參與的過程與作用。

本研究克隆到陸地棉的GhSAMS基因的ORF區(qū)后，對其進行了生物信息學分析預測，預測GhSAMS蛋白質(zhì)是一種親水性的細胞蛋白質(zhì)，另外預測了GhSAMS蛋白質(zhì)含有一些磷酸化位點，因而推測其功能的行使與激酶磷酸化可能相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)這個基因受黃萎病菌脅迫誘導表達，推測其可能與植物抗病防御反應有關(guān)。成功構(gòu)建了GhSAMS基因的病毒沉默載體，也轉(zhuǎn)化到嫁接的棉花植株，發(fā)現(xiàn)沉默該基因使其喪失功能后，會導致棉花抗黃萎病抗性的喪失，進一步驗證了這個基因的某些生理功能，即可能參與了棉花的抗病防御反應，為更深入研究其基因功能以及棉花抗黃萎病的相關(guān)途徑提供了理論支持。

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