張志剛+王開梅+楊自文+萬中義+張遵霞

摘要：針對先導(dǎo)化合物篩選中出現(xiàn)的重復(fù)發(fā)酵活性重現(xiàn)性不穩(wěn)定的問題，研究了篩選流程中菌種保藏時間對活性重現(xiàn)的影響，使用不同批次的重復(fù)發(fā)酵樣品對3個殺蟲活性篩選靶標(biāo)和4個除草活性篩選靶標(biāo)進(jìn)行了試驗。結(jié)果表明，使用保藏時間超過一年的菌種進(jìn)行復(fù)篩，60%左右初篩樣品失去原來的活性；而使用保藏時間在半年左右的菌種進(jìn)行復(fù)篩，只有40%左右的菌株失去活性。根據(jù)這一結(jié)果，調(diào)整了篩選流程中重復(fù)發(fā)酵的間隔時間，變集中進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵為分散同步發(fā)酵，根據(jù)初篩結(jié)果同步進(jìn)行的重復(fù)發(fā)酵，81.56%菌株的初篩活性可以重現(xiàn)，大大提高了備選化合物的檢出效率。

關(guān)鍵詞：先導(dǎo)化合物；活性重現(xiàn)；殺蟲和除草活性篩選靶標(biāo)；重復(fù)發(fā)酵。

中圖分類號：S432.4+3；TQ458.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：0439-8114（2016）23-6137-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.032

Abstract： In view of the instable reproducibility of re-fermentation activities in screening of lead compounds， the effects of storage time on the reproducibility of activity in screening process were studied. Several batches of re-fermentation samples were used to test against 3 insecticide targets and 4 herbicide targets. The results showed that in screening of strains in storage for 1 year， about 60% of screening samples lost their initial activities， but in screening of strains with half a year's storage， only about 40% of strains lost activities. Adjusting re-fermentation intervals according to the results， and changing the concentrated re-fermentation into a decentralized re-fermentation in synchronization， the re-fermentation in accordance with the preliminary screening concluded that about 81.56% strains could realize the preliminary screening activity， which greatly improved the detection efficiency of alternative compounds.

Key words： lead compound； reproducibility of activity； insecticide and herbicide targets； re-fermentation

微生物源先導(dǎo)化合物源于微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物，常規(guī)的篩選流程持續(xù)時間長達(dá)數(shù)月。由于發(fā)酵產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，微生物源先導(dǎo)化合物的初篩、復(fù)篩、化合物分離、純化和制備都需要新鮮的發(fā)酵液，對于每年近一百萬份的高通量篩選體系，不可能對每個菌株預(yù)先進(jìn)行大量發(fā)酵，制備足量的發(fā)酵液用于整個流程。近幾年的篩選結(jié)果顯示，每一輪重復(fù)發(fā)酵，有近50%的提取物無法重現(xiàn)活性。重現(xiàn)活性的提取物中，大部分含有殺粉蝶素或格爾德霉素類的高產(chǎn)量、高毒性、廣譜的已知化合物，低產(chǎn)量、低毒性的化合物在重復(fù)發(fā)酵過程中更容易丟失。本研究為提高活性化合物的重現(xiàn)性，對3個殺蟲活性篩選靶標(biāo)和4個除草活性篩選靶標(biāo)進(jìn)行了試驗，以提高先導(dǎo)化合物的篩選效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 先導(dǎo)化合物 篩選靶標(biāo)：狗芽根、油菜、擬南芥、浮萍、小菜蛾、棉鈴蟲、蚜蟲，共7個靶標(biāo)。

1.1.2 瓊脂粉 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型號DH010-4。

1.1.3 試劑 丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、吐溫-80試劑，以上試劑均為市售分析純化學(xué)試劑。

1.1.4 供篩選試驗樣品 放線菌、真菌發(fā)酵提取物，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物工程研究室提供；提取物組分及純化樣品由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心化學(xué)分析研究室提供；供試靶標(biāo)由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 B100-1F蠕動泵、BIOHIT eLINE八能道電子移液器、Intega96通道移液機(jī)、96孔組織培養(yǎng)板、24孔組織培養(yǎng)板、人工氣候室。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的選擇及分組 長期冷凍保藏的菌株為2014年2～12月完成初篩的菌株。選擇初篩有殺蟲或除草活性的菌株進(jìn)行分組，僅對一個靶標(biāo)有活性的菌株為第一組，對兩個及兩個以上靶標(biāo)有活性的菌株為第二組。未經(jīng)長期冷凍保藏的菌株選擇范圍為2015年6月至2016年2月完成初篩的菌株，選擇初篩有殺蟲或除草活性的菌株按活性進(jìn)行分組，僅對一個靶標(biāo)有活性的菌株為第三組，對兩個及兩個以上靶標(biāo)有活性的菌株為第四組。

1.2.2 菌株活化和重復(fù)發(fā)酵及提取 對“1.2.1”選擇的4組菌株進(jìn)行活化和重復(fù)發(fā)酵。發(fā)酵液立即進(jìn)行凍干、提取和干燥，每一個提取物分別用甲醇溶解后分成3等份，其中一份用于生物測定，一份用于高效液相色譜分析，一份冷凍保存。

1.2.3 重復(fù)發(fā)酵提取物的篩選及與原始發(fā)酵提取物的篩選結(jié)果比較

1）提取物的生物測定。把各提取物配制成母液，濃度以發(fā)酵液體積為基準(zhǔn)，每4 mL發(fā)酵液的提取物為一個單位，加入0.1 mL乙醇溶解，然后加入0.9 mL無菌水制成母液。以人工飼料表面涂布法進(jìn)行小菜蛾和棉鈴蟲的生物測定[1]，以浸葉法進(jìn)行蚜蟲的生物測定，以瓊脂表面涂布法進(jìn)行油菜、狗芽根、擬南芥除草活性的生物測定[2]，以浸漬法進(jìn)行浮萍除草活性的生物測定。

各組織培養(yǎng)板中加入人工飼料或瓊脂量為0.2 mL/孔，表面涂布提取物溶液量為0.02 mL/孔，每個濃度設(shè)2個重復(fù)。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，相對濕度70%～80%，光照時間14 h/d。7 d后檢查并記錄結(jié)果。

2）活性評價指標(biāo)。根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用兩項指標(biāo)標(biāo)記除草活性[3]：種子不萌芽的標(biāo)記為9，植株長勢（株高）不及空白對照的標(biāo)記為5，與空白對照相近則標(biāo)記為0；第二種以植株黃化為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、5Y、9Y分級。殺蟲活性分為三級[4]，幼蟲全部死亡標(biāo)記為9，幼蟲部分死亡或生長緩慢標(biāo)記為5，與空白對照相近標(biāo)記為0。

3）活性結(jié)果比對[5]。比較原始提取物與重復(fù)發(fā)酵提取物的活性吻合率。在本試驗中，只要復(fù)篩活性發(fā)生變化，無論靶標(biāo)增加或減少，都統(tǒng)計為復(fù)篩活性與初篩活性不吻合。而在實(shí)際篩選流程中，只要對任一靶標(biāo)有活性，均視為重復(fù)有活性，可以進(jìn)入下一步篩選步驟。

1.2.4 根據(jù)初篩結(jié)果選擇有活性的菌株，同步進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵 常規(guī)的復(fù)篩流程，需要集中一批初篩有活性的樣品，通常60～90個，然后同時進(jìn)行搖瓶發(fā)酵、提取、干燥、分析。每次發(fā)酵都要進(jìn)行菌種活化、二級發(fā)酵、提取、干燥、生物測定等，整個流程時間長，而且各環(huán)節(jié)之間有時間間隔，重復(fù)發(fā)酵時間間隔通常在25周以上。本試驗根據(jù)每周初篩結(jié)果，對初篩有活性的樣品，同步進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵；所用菌種為近期進(jìn)行第一次發(fā)酵，菌種只經(jīng)過短期低溫保存（4 ℃），初篩與重復(fù)發(fā)酵間隔時間為5～6周。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期冷凍保藏（-20 ℃）菌株，經(jīng)過重新活化、發(fā)酵、提取后進(jìn)行篩選的結(jié)果

2.1.1 長期冷藏殺蟲活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 為準(zhǔn)確地比較復(fù)篩活性重現(xiàn)，把殺草活性和殺蟲活性分別進(jìn)行分析。試驗結(jié)果（表1）顯示，除了對蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣品外，其他活性樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均較低，平均重現(xiàn)率為39.02%。

2.1.2 長期冷藏除草活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果

2014年2～12月擬南芥尚未進(jìn)行常規(guī)篩選，所以本批樣品復(fù)篩中沒有擬南芥進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果（表2）顯示， 除了對油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品外，其他樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均低，平均重現(xiàn)率為33.92%。

2.2 短期低溫保藏（4 ℃）菌株重復(fù)發(fā)酵后進(jìn)行篩選的結(jié)果

2.2.1 短期冷藏殺蟲活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 表3顯示，對蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣品重現(xiàn)率達(dá)到100%，其他活性樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均大于50%，平均重現(xiàn)率為59.85%。

2.2.2 短期冷藏除草活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 表4顯示，對擬南芥、油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品重現(xiàn)率為100%，其他活性樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均高于50%，平均重現(xiàn)率為66.95%。

2.3 復(fù)篩菌株進(jìn)行同步發(fā)酵的結(jié)果

從2016年4月開始，對初篩有活性的菌株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，連續(xù)7周。每周進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵樣品20株左右。重復(fù)發(fā)酵和第一次發(fā)酵時間間隔為6周左右。選擇具有殺蟲或除草活性的182個菌株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵。重復(fù)發(fā)酵成功179株，3株生長不正常，復(fù)篩重現(xiàn)活性的樣品共146個，活性重現(xiàn)率為81.56%。

3 討論

以生物測定活性為導(dǎo)向的微生物源先導(dǎo)化合物篩選，需要經(jīng)過初次發(fā)酵、生物測定、重復(fù)發(fā)酵和活性確認(rèn)，然后進(jìn)行大量發(fā)酵，對目標(biāo)化合物進(jìn)行預(yù)選、分離、純化和結(jié)構(gòu)分析。獲得一個新化合物的整個篩選流程持續(xù)時間需要40周以上。在整個流程中，經(jīng)過幾次重復(fù)發(fā)酵、提取和純化后，其間不斷有活性化合物流失。從本研究結(jié)果可以看出，重復(fù)發(fā)酵對活性樣品的流失影響很大，隨著重復(fù)發(fā)酵間隔時間的減小，活性重現(xiàn)率提高；在實(shí)際篩選中，菌種活化、二級發(fā)酵、提取、生物活性測定、高效液相色譜分析等，每個步驟完成時間至少需要2～4周，盡可能縮短各步驟的時間間隔，可以提高活性樣品的重現(xiàn)率。相對于含量和活性普遍都低的新化合物，高產(chǎn)量、高毒力的已知活性化合物，往往重現(xiàn)率很高，因此保持篩選流程中活性成分的穩(wěn)定性，是提高篩選效率的關(guān)鍵技術(shù)之一。另外，重復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、提取時間、溫度、干燥、樣品保存、分離、純化回收率等，也會引起部分活性成分的損失，對活性化合物的重現(xiàn)性也有一定的影響。

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