趙麗君+冉艷+安莎+楊昌彪+李占彬

摘要：建立一種超聲提取-液相色譜三重四級桿聯(lián)用法（LC-MS/MS）同時測定豆芽中2，4-滴、6-芐基腺嘌呤2種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。酸化甲醇作為提取溶劑，渦旋2 min，超聲波提取10 min，酸化甲醇定容；反相色譜柱分離，電噴霧離子化（ESI+/-）和多離子反應監(jiān)測（MRM）方式定量測定；加標回收試驗2，4-滴添加濃度分別為5，10，20 μg/kg，6-芐基腺嘌呤添加濃度為5，10，20 μg/kg，平均回收率為85.0%～105.3%，相對標準偏差（RSD）1.0%～3.2%；2，4-滴，6-芐基腺嘌呤檢出限分別為1.0、2.0 μg/kg。方法快捷、簡便、樣品前處理時間少，適合食品監(jiān)管中大批量樣品快速測定使用。

關鍵詞：2，4-滴；6-芐基腺嘌呤；液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）；豆芽

中圖分類號：S481+2；TS202.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6228-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.057

Abstract： A method for the simultaneous determination of 2，4-Dichlorophenoxyacetic and 6-benzyladenine in bean sprouts was developed by ultrasonic extraction and LC-MS/MS. Samples were extracted using acidulated methanol as extraction solvent，with 2 min vortex，10 min ultrasonic extraction， and constant volume by acidulated methanol，then were separated with reversed phase column and determined quantitatively with the multiple reaction monitoring（MRM） mode and electrospray ionization（ESI+/-）. The standard recovery tests showed that the additive concentration of 2，4-Dichlorophenoxyacetic were 5，10，20 μg/kg respectively， the additive concentration of 6-benzyladenine were 5，10，20 μg/kg respectively，and the average recovery was in the range of 85.0%～105.3%， the relative standard deviations（RSDs） was in 1.0%～3.2%，and the limit of detections of 2，4-Dichlorophenoxyacetic and 6-benzyladenine was 1 μg/kg and 2 μg/kg respectively. The method was rapid， convenient and cut down pretreatment time of samples， suitable for the rapid determination of large batch samples.

Key words：2，4-Dichlorophenoxyacetic；6-benzyladenine；liquid chromatography-tandem triple quadruple mass spectrometry； bean sprouts

6-芐基腺嘌呤（6-benzylarninopuring，6-BA）是一種人工合成的細胞分裂素，結構見圖1。為白色或類白色晶體，難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中穩(wěn)定。具有抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸和蛋白質(zhì)分解的作用，主要用于糧食、果樹栽培和園藝，作物各個生長階段都可應用[1]。6-BA目前被廣泛用作無根豆芽的生長調(diào)節(jié)劑。人體攝人過多6-BA會刺激皮膚黏膜，造成食道、胃黏膜損傷，出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象[2]。中國將6-BA作為允許使用的食品添加劑，但尚未建立食品中6-BA殘留檢測的國家標準檢測方法。豆芽樣品中6-BA殘留檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法等[3-5]。根據(jù)6-BA的性質(zhì)，目前前處理技術多為酸化甲醇提取目標物供液相色譜或質(zhì)譜進行測定。

2，4-滴（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D），化學名2，4-二氯苯氧乙酸，結構見圖1。不同濃度的2，4-D應用也不同，在高濃度時可殺死雙子葉植物，常用作田間的除草劑。中、低濃度時可以調(diào)節(jié)植物生長，可防止落花落果、誘導無子果實形成和保鮮果實[6]。2，4-D檢測方法沒有相關的國家標準，已報道的檢測方法有氣相色譜法、離子色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-12]。

結合6-BA和2，4-D的性質(zhì)，本研究建立一種快速、方便的LC-MS/MS同時檢測方法，適用于大量樣品的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（Agilent 1200-6410B，配有電噴霧離子源ESI，美國安捷倫公司）；色譜柱ZORBAX-C18，2.1 mm×50 mm，3.5 μm（美國安捷倫公司）；渦旋振蕩器XW-80A（上海精科實業(yè)有限公司）；超聲清洗儀+SK250H（上?？茖С晝x有限公司）；0.22 μm聚四氟乙烯過濾頭（上海安普科學儀器有限公司）。

甲醇（默克）、甲酸（默克）均為色譜純，試驗室用水均為超純水。2，4-D，6-BA標準物質(zhì)均購于中國標準物質(zhì)中心。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為ZORBAX-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm，）美國安捷倫公司；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL；流動相A0.1%甲酸水溶液；流動相B甲醇；等度洗脫A∶B=10∶90。流速為0.2 mL/min。

電噴霧電離負離子模式ESI（2，4-D），正離子模式ESI（6-BA）；多反應監(jiān)測掃描（MRM）；分段檢測，0～3.2 min排廢液，3.2～4.3 min正離子模式掃描（226.3/91.1、226.3/148.2）；4.3～7.0 min負離子模式掃描（221.1/163.2、221.1/124.9）。離子源溫度350 ℃；氣流量入10 L/h，倍增電壓4 000 V。

1.3 樣品前處理

準確稱取粉碎豆芽5.00 g于50 mL聚丙烯離心管中，量筒加入10 mL酸化甲醇提取，渦旋2 min，再超聲提取10 min，5 000 r/min離心10 min，上清液轉入25 mL容量瓶中，樣品加10 mL酸化甲醇重復提取一次。合并上清液并用純水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，上清液供LC-MS/MS分析。

1.4 標準溶液配置

分別稱取2種植物生長調(diào)節(jié)劑標準物，并用甲醇溶解、定容，配制2種植物生長調(diào)節(jié)劑的混合標準溶液，濃度為1.0 mg/mL。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

用甲醇稀釋儲備液，配制濃度為0.1 mg/L混合標準溶液。在質(zhì)譜上先進行全掃描，ESI（+）模式下得到6-BA的分子離子峰，ESI（-）模式下得到2，4-D的分子離子峰，母離子分別為221.1、226.3，應用SIM和Product Ion模式確定2種植物生長調(diào)節(jié)劑的定量和定性離子及相應的質(zhì)譜參數(shù)，見表1。2種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖2。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 不同提取劑的影響 考察環(huán)己烷、正己烷、甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈和1%甲酸水溶液提取效果。在5.00 g樣品中加入20 μg/L添加劑混合標準樣溶液2.0 mL，待溶液完全被樣品吸收后，分別用環(huán)己烷、正己烷、甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈和1%甲酸水作為提取溶劑，按照“1.3”方法進行樣品前處理，應用“1.2”的色譜質(zhì)譜條件上機測定。結果表明，1%甲酸水、環(huán)己烷、正己烷幾乎無法提取目標物。甲醇、乙腈提取率在40%～50%之間，酸化甲醇提取率為90.5%，酸化乙腈的提取率為80.2%。因此，采用酸化甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取時間的影響 考察了相同頻率下，超聲波提取時間的對提取效果的影響。提取時間分別為2、5、10、20、30 min時，5種混標的回收率分別為85.3%，87.6%，87.1%，88.1%，87.4%。從數(shù)據(jù)上分析超聲波提取時間對2種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取影響不顯著，超聲5 min以上提取率已基本穩(wěn)定。選擇超聲波提取時間為5 min，可滿足分析要求。

確定樣品的處理為酸化甲醇超聲波提取時間為5 min，2種植物生長調(diào)節(jié)劑混標（10.0 ng/mL），測得的質(zhì)譜見圖3。

2.3 線性方程、檢出限

配制一系列含2，4-D和6-BA混合標準溶液，濃度范圍在0.1～1 000.0 ng/mL之間。在優(yōu)化的試驗條件下進行測定，以峰面積為x，對應各組分的濃度為y作圖。試驗結果表明，2，4-D在0.1～50.0 ng/mL范圍內(nèi)呈線性；6-芐基腺嘌呤在0.2～50.0 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關系，其線性方程和相關系數(shù)見表2。

采用空白基質(zhì)加標進行測量，以信噪比S/N=3的含量為方法的檢出限（LOD），以信噪比S/N=10的含量為定量限（LOQ），2種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限和定量限見表2。

2.4 回收率及精密度

在優(yōu)化試驗條件下，選用陰性的豆芽分別添加3個濃度水平的植物生長調(diào)節(jié)劑混合標準溶液，每個添加水平平行測定6次，結果見表3。2種植物生長調(diào)節(jié)劑的平均回收率為85.0%～105.3%，相對標準偏差（RSD）小于5.0%，方法的準確度與精密度均滿足日常監(jiān)測要求。

3 結論

建立了豆芽中2種植物生長調(diào)節(jié)劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。利用酸化甲醇為提取溶劑，采用超聲提取，應用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的ESI正負切換模式同時測定豆芽中2種生長激素，2，4-D、6-BA檢出限分別為1.0、2.0 μg/kg。該方法前處理簡單，應用儀器的MRM模式，大大降低了干擾，適合進行大批量樣品的測定。

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