鄧文+熊雙偉+于翠+李勇+莫榮利+熊超+胡興明

摘要：采用Biolog微生態(tài)技術(shù)，研究長期（4年-4Y，17年-17Y，32年-32Y）偏施氮肥桑樹根際土壤微生物碳源利用能力變化。結(jié)果表明，不同施肥年限及不同取樣時期桑樹根際土壤微生物利用單一碳源能力不同，4Y土壤微生物活性（AWCD）、Shannon多樣性指數(shù)及對糖類、氨基酸類、胺類碳源的利用能力均高于其他處理土壤，且與32Y土壤均達顯著差異水平（P<0.05）；主成分分析表明，4Y土壤和17Y土壤與32Y土壤間微生物碳代謝功能差異較大；逐步回歸分析表明，碳源利用Shannon多樣性指數(shù)與土壤有機質(zhì)含量、pH及速效氮含量有一定相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：桑樹；根際微生物；碳源利用能力

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6108-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.025

Abstract： Changes in soil microbial carbon source utilization ability of mulberry rhizosphere in long-term partial application of nitrogen fertilizer were investigated by using Biolog micro ecological technology. The results showed that the carbon utilization ability in different fertilization years and sampling date was different. The AWCD， Shannon diversity index and the utilization ability of carbohydrates， amino acids， amines in 4Y soils were higher than in other treatment soils， and had significant difference compared with 32Y soils（P<0.05）. The principle components analysis indicated that there was significant difference between 4Y， 17Y soils and 32Y soils. Stepwise regression analysis indicated that there was certain（P<0.01） correlations among Shannon diversity index and organic matter content， pH， and available nitrogen content.

Key words： mulberry； rhizospheric microorganism； carbon source utilization ability

據(jù)研究，微生物在養(yǎng)分轉(zhuǎn)運和土壤肥料維持方面具有重要作用[1，2]；施用氮肥影響土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和碳代謝功能多樣性，但施用一定量的氮肥對土壤微生物種群結(jié)構(gòu)或多樣性無影響[3-8]；氮肥施用對土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和碳代謝功能多樣性的影響比較復雜，可能與植物類型、氮肥用量、氮肥施用年限以及生物和非生物因素等有關(guān)[9-11]。

湖北省是中國中部地區(qū)重要的蠶桑生產(chǎn)基地，桑園大多分布在山坡地帶，桑園立地條件普遍較差，桑樹產(chǎn)葉量較低，為獲得桑葉高產(chǎn)，蠶農(nóng)長期偏施氮肥（氮肥用量高達450 kg/hm2），降雨過后桑園土壤板結(jié)，土壤酸化現(xiàn)象嚴重[12]。過量施用氮肥不僅導致土壤對氮素的調(diào)控功能下降，還會污染漳河、沮河等長江重要支流，對三峽庫區(qū)、丹江口庫區(qū)造成面源污染，影響丹江口水庫的水質(zhì)。目前對長期過量施用氮肥對桑園土壤微生物多樣性的影響[13，14]的研究很少。本研究目的是明確長期過量施用氮肥對桑園土壤微生物利用碳源的影響，為桑園科學施肥管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗處理

試驗在湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所桑樹資源圃進行，以資源圃1982、1997和2010年栽植的育71-1（Morus alba L.）為試驗材料，株行距為1.0 m×1.5 m，栽植后，根據(jù)當?shù)匦Q農(nóng)的生產(chǎn)習慣，每年施450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2過磷酸鈣、180 kg/hm2硫酸鉀鎂，春季溝施40%，夏伐后溝施60%。

1.2 土壤樣品采集

2014年和2015年，在大蠶用葉期（5月）、夏伐后新梢旺長期（7月）、新梢緩慢生長期（9月）、新梢停長期（11月），采集施肥年限分別為4年（4Y）、17年（17Y）、32年（32Y）的土壤樣品，鏟去表土，深挖5～20 cm，將土壤連同桑樹根系一起裝入無菌袋、編號。土樣帶回實驗室后，將同一處理的樣品混合，采用抖根法[15]取根際土壤與非根際土壤，并分成2份，一份土樣（約200 g）于4 ℃保存，供微生物分析，另一份土樣自然風干，供土壤理化性質(zhì)分析[16]。土壤樣品的基本理化性質(zhì)見表1。

1.3 桑園土壤微生物功能多樣性測定與計算方法

利用Biolog（Biolog Eco PlateTM）技術(shù)，采用Garland等[17]的方法并稍加變動，研究土壤微生物碳代謝多樣性。在5 g土壤樣品中加入45 mL滅菌8.5 g/L NaCl溶液，在搖床上振蕩15 min，靜置片刻，然后將土壤樣品稀釋（稀釋度10-3），用排槍吸取稀釋液至96孔Biolog Eco板中，150 μL/孔，將接種好的板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h在590 nm處讀取數(shù)據(jù)。培養(yǎng)時間共168 h。

微平板中溶液吸光值平均單孔顏色變化率（AWCD）用于描述土壤微生物代謝活性。計算方法如下：AWC（Ci-Ri）/n，式中Ci為每個有培養(yǎng)基孔的光密度值，Ri為對照孔的光密度值，n為培養(yǎng)基孔數(shù)，Biolog Eco板n值為31。參照郭正剛等[18]的方法，用Shannom-Wiener多樣性指數(shù)（H）描述土壤微生物多樣性豐度，用96 h的平均單孔顏色變化率AWCD值計算H。多樣性指數(shù)H=-ΣPilnPi，式中，Pi為第i孔的相對光密度值與整個微平板的相對光密度值總和的比值，Pi=（Ci-Ri）/Σ（Ci-Ri）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

土壤理化測試數(shù)據(jù)和微生物多樣性指數(shù)的顯著性分析采用單因素方差分析，選取120 h的平均顏色變化率AWCD對微生物碳源利用進行分析，方差分析和主成分分析采用SPSS19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹根際土壤微生物AWCD變化

平均單孔顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物群落對單一碳源整體利用情況，代表土壤微生物活性。從圖1可以看出，在168 h的培養(yǎng)期間，各處理土壤AWCD從24 h開始迅速提高，144 h左右達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此，本研究選擇光密度增加時期即120 h的光密度用于統(tǒng)計分析。不同施肥年限及不同取樣時期桑樹根際土壤微生物利用單一碳源能力不同，4Y和17Y土壤微生物利用單一碳源的能力AWCD高于32Y土壤；不同取樣期間比較，11月份取樣4Y和17Y土壤AWCD顯著高于其他取樣日期。逐步回歸分析表明，土壤有機質(zhì)含量與AWCD顯著相關(guān)（表2）。

2.2 桑樹根際土壤微生物群落對Biolog Eco板6類碳源的利用

微生物對不同碳源的利用可以反映微生物的代謝功能類群?？傮w而言，4Y土壤微生物對不同碳源的利用能力較強，而32Y土壤微生物碳源利用能力較弱（圖2）。4Y土壤微生物對糖類、氨基酸類及胺類碳源的利用高于其他年限土壤，且與32Y土壤在4次取樣時期均達差異顯著水平（P<0.05）。從多樣性指數(shù)看，各取樣時期4Y土壤Shannon多樣性指數(shù)顯著高于32Y土壤（P<0.05，圖3）。逐步回歸分析表明，Shannon多樣性指數(shù)與土壤有機質(zhì)含量、pH及速效氮含量有一定相關(guān)關(guān)系（表2）。

2.3 桑樹根際土壤微生物對碳源利用的主成分分析

碳源利用能力主成分分析見圖4。不同施肥年限土壤及不同取樣日期之間有較大的分離，表明土壤微生物代謝特征表現(xiàn)出較大差異。第1主成分和第2主成分分別解釋土壤微生物代謝31種基質(zhì)的62.46%和15.21%（2014年）及66.45%和14.50%（2015年）的變異。4Y土壤和17Y土壤間離散距離較小，而與32Y土壤間的離散距離較大，表明不同施肥年限顯著影響土壤微生物碳代謝功能群結(jié)構(gòu)。

3 小結(jié)與討論

前人研究表明，不合理的肥料種類及數(shù)量可能導致土壤環(huán)境的惡化，并破壞土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[19，20]。本研究結(jié)果表明，與4Y和17Y相比，32Y土壤微生物碳源利用能力顯著降低（圖1、圖2）；土壤微生物對氮肥的反應(yīng)取決于許多因素，包括肥料類型、肥料數(shù)量、應(yīng)用時間、土壤特性及作物類型等，對于桑樹，長期施用氮肥每年施450 kg/hm2，確實減少了土壤微生物碳源利用能力及多樣性。

前人對茶、番茄、棉花、煙草等的研究表明，土壤微生物的活性和功能多樣性隨栽植時間的增加而減少[21-23]。Fu等[23]報道，蘆筍土壤微生物種群結(jié)構(gòu)隨栽培時間的延長而減少。本研究中17Y和32Y土壤微生物多樣性的減少不僅取決于栽培時間，而且與施肥管理關(guān)系更密切。因此，不同植物類型對栽培時間及不同肥料的反應(yīng)需要進一步深入研究。

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