謝 飛 王衛(wèi)星

原發(fā)性肝癌組織MicroRNA-497表達(dá)及與患者臨床特征和生存率的關(guān)系

謝 飛 王衛(wèi)星*

目的：回顧性分析microRNA-497(miRNA-497)在原發(fā)性肝癌(HCC)患者癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征和生存率的關(guān)系。方法：收集 2010-01—2010-10接受手術(shù)治療的61例HCC患者，采用熒光定量PCR檢測其癌組織及癌旁組織miRNA-497的相對表達(dá)量。以癌組織miRNA-497相對表達(dá)水平的中位數(shù)為界限，將61例患者分為miRNA-497高表達(dá)組(n=21)和miRNA-497低表達(dá)組(n=40)。比較癌組織與癌旁組織miRNA-497水平差異；同時(shí)分析miRNA-497高表達(dá)組與miRNA-497低表達(dá)組臨床特征和預(yù)后危險(xiǎn)因素；比較兩組平均生存率和累計(jì)生存率的差異。結(jié)果：miRNA-497在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCC患者癌組織miRNA-497低表達(dá)組血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯與高表達(dá)組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素回歸分析顯示血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表達(dá)量是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表達(dá)組平均生存期明顯低于高表達(dá)組(19.0個(gè)月vs 33.3個(gè)月)，1年、3年、5年累計(jì)生存率也較miRNA-497高表達(dá)組明顯降低(55.0% vs 71.4%、20.0% vs 42.9%、15.0% vs 37.5%，P<0.05)。結(jié)論：miRNA-497在HCC組織中的低表達(dá)提示預(yù)后不良。

原發(fā)性肝癌； microRNA-497； 生存率

原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是國人常見惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發(fā)展快、惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高及預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。已有研究表明微小RNA(MicroRNA，miRNA)在許多腫瘤中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用[2]，因而受到腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)研究的廣泛關(guān)注。截至目前，miRNA-497與較多惡性腫瘤的關(guān)系已見報(bào)道，但其與HCC的關(guān)系，包括在癌組織中的表達(dá)量及與患者臨床特征和術(shù)后生存率的關(guān)系所見報(bào)道甚少。本研究對此進(jìn)行了初步探討，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例分組及資料獲取

本院2010-01-2010-10收住院HCC患者61例，均切除癌組織并經(jīng)病理組織學(xué)檢查(HE染色)診斷為HCC，如圖1。同時(shí)取少部分癌組織和癌旁組織保存于-80℃冰箱中待測miRNA-497。以此次61例HCC癌組織miRNA-497相對表達(dá)水平的中位數(shù)為界值，將上述患者分為miRNA-497高表達(dá)組(21例，miRNA-497≥0.24)和miRNA-497低表達(dá)組(40例，miRNA-497<0.24)。

查閱病歷檔案，獲取兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、有無乙肝和肝硬化、HCC家族遺傳史、甲胎蛋白(AFP)水平、抗病毒治療情況、腫瘤個(gè)數(shù)、大小以及包膜完整性、血管侵犯、Edmondson分級[3]、TNM分期[4]、Chlid-pugh分級[5]等臨床資料。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，同時(shí)取得患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 miRNA-497水平檢測

1.2.1 主要試劑及儀器：Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，SYBR?Premix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)。miRNA-497上游引物為5’-ACA CTC CAG CTG GGC AGC AGC ACA CTG TG-3’，下游引物為5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA AAC CA-3’；內(nèi)參U6上游引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物為5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，均由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提?。簭?80℃冰箱中取出標(biāo)本，液氮研磨肝癌組織及其癌旁組織，組織勻漿后加入Trizol試劑，按照說明書提取總RNA。采用核酸微量檢測儀檢測總RNA純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.2.3 熒光定量PCR：取A260/A280在1.8-2.0的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl，按照Takara公司提供的逆轉(zhuǎn)錄說明書操作。具體反應(yīng)條件為：37℃ 30min，95℃ 5s，4℃保存。再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件為：50℃ 2min，95℃ 2min， 60℃

圖1 HCC患者癌組織及癌旁組織病理結(jié)果(HE，×100)

30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)擴(kuò)增三次，取均值為該樣本的檢測水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算。以U6作為內(nèi)參。有多個(gè)腫瘤的患者檢測每個(gè)腫塊的miRNA-497相對表達(dá)量，計(jì)算均值為該患者腫瘤組織中miRNA-497的相對表達(dá)量。

1.3 隨訪方法

所有患者術(shù)后第一個(gè)月隨訪一次，以后每3個(gè)月隨訪一次，2年后每6個(gè)月隨訪一次。隨訪方式為電話詢問，截止日期為2015-10，隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者癌組織和癌旁組織miRNA-497表達(dá)量

HCC患者癌組織中miRNA-497的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織(0.25±0.03 vs 0.99±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.125，P<0.05)，見圖2。

注：與癌旁組織相比較，*P<0.05

2.2 不同miRNA-497表達(dá)量HCC患者一般資料和臨床特征

表1顯示，不同miRNA-497表達(dá)量的兩組HCC患者血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯等指標(biāo)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，而其它指標(biāo)的組間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同miRNA-497表達(dá)量HCC患者一般資料和臨床特征比較

注：與miRNA-497低表達(dá)組相比，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 HCC患者預(yù)后因素回歸分析

單因素和多因素回歸分析顯示，血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表達(dá)量是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表2。

微循環(huán)學(xué)雜志2017年第27卷第1期臨床研究 ▲

表2 HCC患者預(yù)后的單因素和多因素分析

2.4 miRNA-497低表達(dá)和高表達(dá)HCC患者生存率比較

Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表達(dá)組平均生存期明顯低于miRNA-497高表達(dá)組(19.0個(gè)月vs 33.3個(gè)月)，1年、3年、5年累計(jì)生存率也明顯低于高表達(dá)組(55.00% vs 71.40% 、20.00% vs 42.90% 、15.00% vs 37.50%，均P<0.05)，見圖3。

圖3 miRNA-497低表達(dá)組和高表達(dá)組HCC患者生存率

3 討 論

miRNA是由19-22個(gè)核苷酸分子構(gòu)成的高度保守非編碼的內(nèi)源性單鏈小RNA。通過與特定的mRNA結(jié)合，降解或者抑制其翻譯過程，從而參與早期胚胎和器官發(fā)育、正常細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞分化等生物學(xué)行為。同時(shí)，miRNA在人體腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡中也起著重要作用[3]，可促進(jìn)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌等的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移[4]。

miRNA-497位于人類染色體17p13.1上，其AGCAGC序列起始于成熟體5’末端的第一個(gè)或第二個(gè)核苷酸，屬于miR-15/107家族中的一員[5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者癌組織的miRNA-497表達(dá)明顯低于癌旁組織[6]。miRNA-497在結(jié)直腸癌中的表達(dá)也明顯低于正常結(jié)腸組織，從而使胰島素樣生長因子受體(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor，IGF1-R)的表達(dá)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/Protein Kinase B, PI-3K/PKB )信號通路受抑，減少IGF1-R和PKB活化，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者惡性程度增加[7]，miRNA-497在HCC患者癌組織中也表現(xiàn)為低表達(dá)[8]，而且其低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1(Cell-cycle-checkpoint kinase 1, CHEK1)高表達(dá)，加重HCC患者不良預(yù)后[9]。

本文結(jié)果證實(shí)，HCC患者癌組織中miRNA-497表達(dá)量明顯低于癌旁組織，表明miRNA-497對HCC的發(fā)生和發(fā)展起到一定的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miRNA-497低表達(dá)組HCC患者部分臨床特征，如血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯均與高表達(dá)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。間接說明miRNA-497低表達(dá)與HCC患者癌組織增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究通過對胰腺癌組織分析表明，miRNA-497低表達(dá)患者累計(jì)生存率明顯低于高表達(dá)患者，提示臨床可以通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)和成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)的表達(dá)來調(diào)控胰腺癌的惡性表型和化療敏感度，從而為胰腺癌的靶向治療提供一定的方向[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-497低表達(dá)患者術(shù)后1年、3年、5年生存期明顯低于高表達(dá)組(55.00%、20.00%、15.00% vs 71.40%、42.90%、37.50%)，平均生存期也明顯低于高表達(dá)組(19.0個(gè)月 vs. 33.3個(gè)月)，也可借鑒以上途徑為HCC治療尋找方向。在目前對于HCC患者miRNA-497低表達(dá)及低表達(dá)患者生存率低于高表達(dá)的具體原因和機(jī)制尚不清楚的情況下，加強(qiáng)miRNA-497低表達(dá)患者隨訪，密切監(jiān)測患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，及時(shí)采取治療措施，對延長患者生命具有積極意義。

綜上所述，HCC患者癌組織miRNA-497的表達(dá)量分析可以用于評估患者的預(yù)后，也可為HCC的靶向治療提供初步依據(jù)，但本文納入病例較少，有待大樣本驗(yàn)證，更需加強(qiáng)相關(guān)機(jī)制研究。

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本文第一作者簡介：

謝 飛(1982年-)，男，漢族，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事普外科腫瘤研究

微循環(huán)學(xué)雜志2017年第27卷第1期重癥救治病例 ?

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The Expression of MicroRNA-497 in Hepatocellular Carcinoma and its Relationship with Clinical Features and Survival Rate

XIE Fei, WANG Wei-xing*

Department of General Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China；*

Objective: To explore the value of the microRNA-497 expression and clinical significance in hepatocellular carcinoma(HCC).Method: Paired HCC tumor tissues and adjacent non-tumor liver tissues were collected from 61 HCC patients who underwent hepatectomy between January 2010 and October 2010 at our hospital. miRNA-497 was quantified using the RT-PCR. 61 patients were divided into miRNA-497 high expression group (n=21) and miRNA-497 low expression group (n=40), according to the limit of the median expression level of miRNA-497 in tumor tissues. Then, we compared the difference of miRNA-497 levels between cancer tissues and adjacent tissues and analyzed the difference of clinical data and survival rate between miRNA-497 high expression group and miRNA-497 low expression group and found the risk factors of prognosis of patients with HCC.Results: The level of miR-497 was significantly down-regulation compared to paracarcinomatous liver tissues (P<0.05), miR-497 expression was also negatively correlated with serum AFP level, tumor size, TNM stage and venous invasion (allP<0.05). In addition, Kaplan Meier survival analysis showed that the 1-, 3-, and 5-year overall survival rates were lower in the low miR-497 exprssion than the high miR-497 exprssion ( 55.0%, 20.0%, 15.0% vs 71.4%, 42.9%, 37.5%,P<0.05). Multivariable Cox regression analysis revealed that miR-497, TNM stage and venous invasion were independent risk factors for overall survival. Conclusion: miR-497 was down-regulated in HCC and can be served as a novel prognostic marker for HCC.

Hepatocellular carcinoma; MicroRNA-497; Overall survival

武漢大學(xué)人民醫(yī)院普外科，武漢 430060；*

，E-mail:309047@qq.com

本文2016-11-22收到，2017-01-16修回

R735.7

A

1005-1740(2017)01-0047-05