付海濱，閆超杰，李 姝，劉曉超，張 敏

（1.沈陽檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，遼寧沈陽 110016； 2.沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，遼寧沈陽110016； 3.錦州出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧錦州 121013； 4.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866）

數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

付海濱1，2，閆超杰3，李 姝1，2，劉曉超2，張 敏4

（1.沈陽檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，遼寧沈陽 110016； 2.沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，遼寧沈陽110016； 3.錦州出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧錦州 121013； 4.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866）

近年來，世界各國都非常重視轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)的研究和應(yīng)用，因此，建立快速簡單、高靈敏度、高精確度的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法十分必要。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)作為一種全新的核酸檢測方法，近年來在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域備受青睞。文中介紹了數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)的基本原理，概述了其在轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。

數(shù)字PCR；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品；檢測方法

自1996年轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)商業(yè)應(yīng)用以來，轉(zhuǎn)基因作物的商品化種植得到迅速發(fā)展。2014年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1.815億hm2，年增長率為3%～4%，比2013年的1.752億hm2增加了630萬hm2（圖1所示）［1］。然而，隨著全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量逐漸增加，轉(zhuǎn)基因作物及其加工食品的安全性的爭論迅速席卷全球，使人們對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性充滿了質(zhì)疑。隨后，各國政府紛紛出臺了一系列有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品管理的規(guī)定和法律法規(guī)，很多國家還限定轉(zhuǎn)基因含量達(dá)到一定閾值的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識。快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全監(jiān)管的重要工具，因此，建立快速簡單、高靈敏度、高精確度、絕對定量的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。

目前國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)制品的檢測主要是基于外源蛋白靶標(biāo)和外源核酸成分的檢測來展開的，建立了一系列常見的快速、靈敏的轉(zhuǎn)基因定性和定量檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（isothermal amplification）和基因芯片技術(shù)（gene chip）等，但目前在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用最多的還是基于核酸序列的PCR檢測方法［2］。

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來迅速發(fā)展起來的一種全新的核酸檢測定量分析技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閡值（Ct）進(jìn)行定量，不受擴(kuò)增效率的影響，也不需要采用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以實(shí)現(xiàn)絕對定量分析，dPCR具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優(yōu)點(diǎn)，該方法在轉(zhuǎn)基因定量分析、物種鑒定、醫(yī)學(xué)診斷、致病微生物定性和定量等領(lǐng)域有較為寬闊的應(yīng)用前景［3～5］。為此，文中介紹了數(shù)字PCR技術(shù)的基本原理及其在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的基本原理

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）的概念最早是由美國科學(xué)家Vogelstein等于1999年提出的，即通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子（DNA模板），在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［6］。數(shù)字PCR（也可稱單分子PCR）一般包括兩部分內(nèi)容，即PC R擴(kuò)增和熒光信號分析。在PCR擴(kuò)增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，數(shù)字PCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng)，也不同于qPCR對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測定的方法，數(shù)字PCR技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集（圖2所示），最后通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量［7］。

2 數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用

數(shù)字PCR作為更精確和更靈敏的DNA定量檢測新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單分子DNA的絕對定量，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量分析提供了新的技術(shù)手段。目前商業(yè)化的dPCR技術(shù)可以分為兩大類：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技術(shù)［5］。近年來國內(nèi)外學(xué)者不斷探索利用數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測研究。在國外，Corbisier等（2010）利用數(shù)字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)之比，該結(jié)果與利用普通熒光定量PCR技術(shù)以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測的結(jié)果相同，證明了數(shù)字PCR技術(shù)的可靠性［8］。

圖1 全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積

圖2 數(shù)宇PCR原理示意圖

Burns等（2010）通過Fluidigm數(shù)字PCR（Fluidigm chamber dPCR，cdPCR）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因樣品含量分析，評估了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測中檢測限（LOD）和定量限（LOQ），探索了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的可行性和反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)該平臺靈敏度達(dá)到5 copies/assay，表明數(shù)字PCR能夠準(zhǔn)確地對起始模板拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量［9］。Dany等（2013）應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了精確定量分析［10］。Song（2015）通過基于QuantStudioTM3D數(shù)字PCR平臺對轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行定量及拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)與Southern blot及qRT-PCR方法相比數(shù)字PCR檢測時(shí)間更短且具有較好的檢測極限［11］。Dobnik等（2015）應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，建立了針對歐盟授權(quán)的12種轉(zhuǎn)基因玉米品系轉(zhuǎn)基因成分多重定量分析方法［12］。K?ppel等（2015）建立了基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因成分快速定量分析方法［13］。

我國數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用起步較晚，近幾年很多學(xué)者也利用不同的數(shù)字PCR技術(shù)平臺，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究。隋志偉等（2013）應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)成功研制了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［14］。姜羽等（2014）建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因成分外源基因拷貝數(shù)分析方法［15］。潘廣等（2016）基于微滴式數(shù)字PCR平臺在國內(nèi)首次建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系T25單、雙重微滴式數(shù)字PCR定量方法，結(jié)果表明，所建立的T25品系雙重PCR方法能特異性檢出轉(zhuǎn)基因玉米T25，而其他轉(zhuǎn)基因玉米、油菜、水稻等作物品系均沒有擴(kuò)增；靈敏度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，所建立的T2雙重?cái)?shù)字PCR方法，在相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25%時(shí)可以檢測到4.6個(gè)T25特異性邊界序列分子，在不考慮各重復(fù)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的情況下可以檢測到1個(gè)拷貝［16］。任怡菲等（2016）建立了轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性數(shù)字PCR定量檢測方法，對方法的適用性鑒定結(jié)果表明，建立的數(shù)字PCR方法特異于轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系檢測［17］；方法可重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，生成微滴數(shù)的RSD值介于0.60%～11.11%之間，小于歐盟定量檢測限25%的要求。于曉帆等（2016）建立了使用數(shù)字PCR檢測轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6品系大豆的定量檢測方法，使用數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測，并確定定量檢測的低限，結(jié)果表明，數(shù)字PCR檢測方法的檢測低限在模板DNA濃度為0.5ng/反應(yīng)、轉(zhuǎn)基因大豆含量為1%時(shí)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%［18］。胡佳瑩等（2016）基于QuantStudioTM 3D數(shù)字PCR平臺，以轉(zhuǎn)基因玉米MON863混合樣品為例，建立基于單重和雙重?cái)?shù)字PCR體系的轉(zhuǎn)基因生物（geneticallymodifiedorganisms，GMOs）含量分析方法，與傳統(tǒng)qRT-PCR比較發(fā)現(xiàn)，在缺乏樣品純度、純合度信息的情況下，數(shù)字PCR能夠較好地排除這些因素的影響，測定準(zhǔn)確的量值［19］；研究結(jié)果表明，QuantStudioTM 3D數(shù)字PCR是一種適用于轉(zhuǎn)基因生物含量分析的精確定量方法。姜志軍等（2016）利用微滴數(shù)宇PCR技術(shù)對玉米自交系501幼胚外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測分析，成功建立了草甘膦抗性基因G23V-EPSPS在玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因作為轉(zhuǎn)基因玉米篩選標(biāo)記基因奠定了基礎(chǔ)［20］；而且以微滴數(shù)宇PCR技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Southern Blot簡便快速的完成外源基因拷貝數(shù)的分析，為微滴數(shù)宇PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因外源基因拷貝數(shù)檢測上的廣泛應(yīng)用做了初步的探索。

3 問題與展望

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品雖然具有諸多優(yōu)勢，但目前并沒有完全被人類接受。世界各國對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品都實(shí)行嚴(yán)格的審批和許可制度，世界衛(wèi)生組織也要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)簽管理，因此，加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因成分的檢測愈發(fā)重要，只有準(zhǔn)確地檢測轉(zhuǎn)基因成分，才能有效的對市場上的轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行監(jiān)控。為此，世界上很多國家和地區(qū)紛紛加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速、高通量、精準(zhǔn)檢測技術(shù)研究。近幾年數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展迅猛，新技術(shù)新方法不斷出現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測提供了新方法。全球各大公司對有前景的數(shù)字PCR技術(shù)競爭激烈，極大地推動(dòng)了該領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，Bio-Rad、ThermoFisher等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字PCR產(chǎn)品，主要有Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統(tǒng)、ThermoFisher公司的QuantStudioTm 3D dPCR系統(tǒng)、Fluidigm公司的Bio-Mark Tm高通量基因分析系統(tǒng)等。

雖然目前數(shù)字PCR檢測方法多處于研發(fā)階段，還沒有真正應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測中，但其綜合了熒光定量PCR的準(zhǔn)確性及基因芯片的高通量，并且不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量，有望成為核酸絕對定量的新標(biāo)準(zhǔn)。因此，今后還需將數(shù)字PCR方法與現(xiàn)有的其他轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)相結(jié)合，不斷優(yōu)化數(shù)字PCR檢測技術(shù)，進(jìn)一步提高數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性，特別是制定并形成一批轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)?shù)字PCR檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，在我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測和監(jiān)管提供技術(shù)支持。

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Application of Digital PCR Technology in Detection of Genetically Modified Components

FU Hai-bin1，2，YAN Chao-jie3，LI Shu1，2，LIU Xiao-chao2，ZHANG Min4
（1．Shenyang Academy of Inspection and Quarantine，Shenyang，Liaoning 110016； 2．Technology Center of Shenyang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenyang，Liaoning 110016； 3．Jinzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinzhou，Liaoning 121013； 4．Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866）

In recent years，many countries attach great importance to the research and application of the detection technology of genetically modified components.Therefore，it is necessary to establish a rapid，simple，high sensitivity and high precision detection method of transgenic components.Digital PCR（digital，dPCR）technology as a new nucleic acid detection methods，in recent years in the field of transgenic detection favored by the PCR.This paper introduces the basic principle of digital PCR（digital，dPCR）technology，and summarizes its application in the field of genetically modified component detection（PCR）.

Digital PCR；Transgenic product；Test method

S188

B

1002-1728（2017）01-0050-04

10.3969/j.issn.1002-1728.2017.01.012

2017-01-05

沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F16-104-4-00）

付海濱（1978-），男，博士，高級農(nóng)藝師，主要從事進(jìn)出口植物及其產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫工作。E-mail：fhbciq@126.com