熊翠玲,張 璐,付中民,王鴻權(quán),侯志賢,童新宇,李汶東,鄭燕珍,陳大福,郭 睿
(福建農(nóng)林大學蜂學學院,福州350002)
基于RNA-seq數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)中華蜜蜂幼蟲的SSR分子標記
熊翠玲*,張 璐*,付中民,王鴻權(quán),侯志賢,童新宇,李汶東,鄭燕珍,陳大福**,郭 睿**
(福建農(nóng)林大學蜂學學院,福州350002)
中華蜜蜂是東方蜜蜂的一個亞種,也是我國的特有蜂種。本研究基于已獲得的中華蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測SSR分子標記,并進行SSR位點的信息分析和SSR引物的發(fā)掘。利用MISA軟件對幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中數(shù)據(jù)組裝得到的43557條 unigenes進行搜索,共預(yù)測出13448個SSR位點,它們分布于7763條 unigene中,其中最主要的重復類型為二核苷酸重復(58.03%),其次為三核苷酸重復(28.23%)和四核苷酸重復(9.72%)。二核苷酸重復中的基序主要是 AT/AT(占總量的30.4%)。對于所有的SSR位點,利用Primer Premier 5軟件成功設(shè)計出21627 對引物,隨機選取 48 對引物對5個不同來源的中華蜜蜂幼蟲腸道樣品進行SSR位點擴增,共有15對成功擴增出符合預(yù)期的目的片段。研究結(jié)果表明利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)中華蜜蜂幼蟲的SSR引物是可行的,本研究開發(fā)出的SSR引物為研究中華蜜蜂分子遺傳學奠定了基礎(chǔ)。
RNA-seq;中華蜜蜂;幼蟲腸道;SSR分子標記
簡單重復序列 (simple sequence repeat, SSR)也稱微衛(wèi)星 (microsatellite),由1-6 個核苷酸堿基為重復單元 (motif)組成。SSR分子標記具有多態(tài)性高、重復性好、實驗操作容易及呈共顯性遺傳等特點 (Jarneetal., 1996),因此廣泛應(yīng)用于動植物及微生物等學科領(lǐng)域。然而,SSR分子標記的特異性在一定程度上限制了其引物的通用性 (Glennetal., 2005)。對于基因序列未知的物種,SSR標記的開發(fā)較為困難。SSR分子標記的傳統(tǒng)開發(fā)方法以基因文庫構(gòu)建法 (包括SSR富集文庫)為主 (Hamiltonetal., 1999; Zaneetal., 2002),但費時費力且效率低下。利用公共數(shù)據(jù)庫 (如NCBI、EMBL和DDBJ)中的共享基因序列挖掘SSR分子標記也是一種較好的方法,但對于非模式生物或新物種而言,有限的基因序列資源嚴重阻礙SSR分子標記的開發(fā)。第二代高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用為規(guī)?;z傳變異檢測 (O’Neilletal., 2013)和分子標記位點開發(fā) (Daveyetal., 2011; Yuetal., 2011; Pandeyetal., 2013)帶來了寶貴機遇。然而,基于高通量測序數(shù)據(jù)挖掘SSR分子標記仍面臨著大數(shù)據(jù)對生物信息學方法和技術(shù)的挑戰(zhàn)。東方蜜蜂Apiscerana(簡稱東蜂)分布廣泛,但各地不同的蜜源和氣候條件使各地的東蜂在形態(tài)和種性上存在諸多差異。中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱中蜂)起源于古喜馬拉雅山系的熱帶、亞熱帶雨林,已適應(yīng)我國各種生態(tài)地理條件,廣泛分布在長江流域的亞熱帶常綠闊葉林區(qū)和稻茶區(qū) (段成鼎, 2003)。目前,中蜂己經(jīng)分化為不同的地理系,并在長期進化中形成其獨特的適應(yīng)性 (楊冠煌, 1983)。較之西方蜜蜂Apismellifera(簡稱西蜂),中蜂具有抗螨害、耐寒、善利用零星蜜粉源等優(yōu)點。
西蜂基因組早在2006年就已完成測序并公布 (Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006),為蜜蜂行為、遺傳進化和基因功能研究提供了重要的參考信息,也有力推動了其SSR分子標記的開發(fā)和應(yīng)用。2015年,韓國的研究人員公布了東方蜜蜂的基因組(Park D, 2015),但當時并沒有公布基因位置及功能注釋信息。目前,中蜂可利用的SSR分子標記極少,有限的基因序列資源極大地限制了中蜂微衛(wèi)星標記的開發(fā),中蜂種群遺傳學研究受到嚴重制約。此前,梁勤等(2009)利用6對微衛(wèi)星DNA標記對福建省4個中蜂群體進行遺傳多樣性分析,評估群體內(nèi)的遺傳變異和群體間的遺傳分化。徐新建(2013)等應(yīng)用10個微衛(wèi)星DNA標記對海南島11個地點和大陸2個地點中蜂分析表明,海南中蜂多樣性豐富,島嶼和鄰近大陸種群發(fā)生了明顯的遺傳分化。本課題組利用RNA-seq技術(shù)對中蜂幼蟲腸道進行轉(zhuǎn)錄組測序,成功組裝了中蜂幼蟲腸道的參考轉(zhuǎn)錄組并對其進行了功能及代謝通路注釋 (未發(fā)表數(shù)據(jù)),可為中蜂的微衛(wèi)星標記開發(fā)提供重要的參考信息。
本研究基于已獲得的中蜂幼蟲腸道RNA-seq數(shù)據(jù),利用MISA軟件搜索所有unigenes中的SSR位點信息,并通過Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性引物,進而對5個不同來源的中蜂幼蟲腸道樣品的SSR位點進行PCR擴增,研究結(jié)果將為中蜂分子遺傳學的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ),也為其它非模式生物或新物種的SSR分子標記挖掘提供方法借鑒。
1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
中蜂幼蟲腸道的轉(zhuǎn)錄組測序委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行,測序平臺為Illumina Hiseq 2500,采用雙端測序 (PE125),RNA-seq共獲得43577 條 unigenes。本研究測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳美國國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI)SRA數(shù)據(jù)庫,SRA號:SRA456721。
1.2 供試蜜蜂幼蟲
本研究用于驗證SSR引物的中蜂幼蟲取自四川、遼寧、福建、江西和廣東。每個來源的中蜂幼蟲分別剖取腸道,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆?。使用組織DNA提取試劑盒 (TIANamp Genomic,中國),提取各腸道樣品的總DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 SSR 鑒定
利用軟件MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben. de/misa/)搜索unigenes的SSR分子標記,標準如下:二核苷酸重復≥6次,三核苷酸重復≥5次,四核苷酸重復≥5次,五核苷酸重復≥5次和六核苷酸重復≥5次。
1.4 SSR 引物設(shè)計與驗證
根據(jù)MISA的輸出結(jié)果,利用Primer Premier 5(PREMIER Biosofe Int., Palo Alto, CA)對每一個含有16 bp堿基重復的SSR設(shè)計特異性引物。設(shè)置目的片段必須包含SSR起始-3 bp,終止+6 bp,擴增片段大小為100-300 bp。引物的長度設(shè)置為18-25 bp,最適長度為 22 bp,引物最大允許有一個不能識別的堿基。設(shè)置引物的退火溫度 (Tm)為55℃-65℃,最適 Tm為58℃,上下游引物間的Tm差異最大允許3℃,引物末端穩(wěn)定性最大為250。引物由上海生工生物工程有限公司進行合成。為驗證設(shè)計引物的穩(wěn)定擴增,隨機挑選 48對引物進行驗證。PCR 反應(yīng)體系為20 μL:其中中蜂幼蟲腸道總DNA模板 1 μL,Mixture 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,無菌水補至20 μL。反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共33個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 4% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2 結(jié)果與分析
2.1 中華蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中 SSR 位點的分布特點
利用MISA軟件對中蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中43577 條 unigenes 進行搜索,共預(yù)測出13448個SSR位點,它們分布于7763 條 unigenes 中,出現(xiàn)頻率 (含有SSR的 unigene 數(shù)量與總 unigene 數(shù)量之比)為17.82%。這些SSR基序包含1-5 bp 的串聯(lián)重復序列。在中華蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,SSR基序的重復類型中總數(shù)最多的是二核苷酸重復,達SSR總數(shù)的58.03%;其次是三核苷酸重復和四核苷酸重復,分別占SSR 總數(shù)的28.23%和9.72%;五核苷酸和六核苷酸重復的數(shù)量很少 (2.53%和 1.49%)(表 1)。中蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組 SSR 重復單元的重復次數(shù)分布在4-24次。二核苷酸重復次數(shù)分布在6-24次,三核苷酸重復次數(shù)分布在5-24次,四核苷酸重復次數(shù)分布在4-24次,五核苷酸重復次數(shù)分布在4-12次,六核苷酸重復次數(shù)分布在4-10次,其中,重復次數(shù)最多的為6次,占24.22%。對SSR 基元出現(xiàn)頻率進行統(tǒng)計,結(jié)果顯示二核苷酸重復中主要是 AT/AT 基元,占總量的30.04%,AG/CT 基元其次,占 22%,其它基元百分比超過2% 的只有AC/GT、AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATT、AGC/CTG、AGG/CCT和AAAG/CTTT,其比例分別為4.7%、2.9%、5.2%、7.2%、2.4%、2.9%和3% (圖 1)。三核苷酸中ACT/AGT基序最少,占SSR總數(shù)的1.3% (圖1)。
圖1 基于基序類型中 SSRs 在中華蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中的出現(xiàn)頻率Fig.1 Frequency distribution of SSRs based on motif types in Apis cerana cerana larval gut transcriptome
重復類型Repeattype重復數(shù)Numberofrepeats4567891011121314>=15合計Total百分比(%)Percentage二核苷酸Dinucleotide--232016091203874595335122149863478045803三核苷酸Triucleotide-15537975791681762602249443811137972823四核苷酸Tetranucleotide6673259412046111697327430972五核苷酸Pentanucleotide2165344382541--326253六核苷酸Hexaucleotide1334723625-1--2201149總計Total1016197832572314143110658813701806113875713448-百分比(%)Pertancage7561471242217211064792655275134045103562--
2.2 中華蜜蜂幼蟲腸道 SSRs引物設(shè)計
利用Primer Premier 5軟件進行SSR引物的批量設(shè)計,針對7209個 unigenes共設(shè)計出21627對SSR引物。隨機挑選48對引物對國內(nèi)5個不同來源的中蜂幼蟲樣品進行擴增,PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,共有15對引物擴增成功 (表2),并且擴增片段與預(yù)期片段大小基本一致 (圖2),有效擴增的比例達31.25%。上述結(jié)果表明基于RNA-seq數(shù)據(jù)開發(fā)SSR引物的方法可行,這些SSR位點多態(tài)性的高低有待于進一步的試驗評估。
圖2 不同來源中華蜜蜂幼蟲腸道樣品 15 個SSR位點的PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of 15 SSR loci in Apis cerana cerana larval gut samples from different regions in China注:A-E,不同SSR引物在各中蜂幼蟲腸道樣品中SSR位點擴增產(chǎn)物電泳;S,四川來源的中蜂幼蟲腸道樣品; L,遼寧來源的中蜂幼蟲腸道樣品; F,福建來源的中蜂幼蟲腸道樣品; J,江西來源的中蜂幼蟲腸道樣品; G,廣東來源的中蜂幼蟲腸道樣品; M, DNA marker;SSR1-15分別代表15對 SSR 引物,引物序列見表2。Note:A-E, Agose gel electrophoresis for PCR amplification of SSR loci in each A. c. cerana larval gut sample using different SSR primers;S, A. c. cerana larval gut sample from Sichuan province; L, A. c. cerana larval gut sample from Liaoning province; F, A. c. cerana larval gut sample from Fujian province; J, A. c. cerana larval gut sample from Jiangxi province; G, A. c. cerana larval gut sample from Guangdong Province; M, DNA marker; SSR1-15 represent 15 pairs of SSR primer and the sequences are shown in Table 2.
編號NoUnigeneID引物序列Primersequence產(chǎn)物大小(bp)Productsize基序和重復數(shù)MotifandrepeatPCR擴增PCRamplification11943F:CATGGCAAAATACGAACACGR:GCCTATCGAATCATCGGAGA251(CTCTC)4(TC)6S21965F:TCGACGGCCTGTACAACATAR:CTCCTCCATCTTCACGTTCC269(GAG)6(CAC)7S32000F:TCCGTTTTCGAAACGAAGATR:AGCACATATCGCATCACGAG173(GAAA)4S42047F:TCTGTAATAGGAAGAACGCGAAR:TCCTCTCCCCCTGTTTTTCT139(TCG)5S52069F:CGGAATCATCGTCATCCTCTR:GTTGCTGTTGTTGAGCCTGA183(TCC)6S62071F:TAAGGTGGATCTCGTCGGAGR:TAGATCCGTCGCGATTTTTC222(AG)8(AG)7(GA)6S72194F:GCCAAGAAGAAACGGAACAAR:GCCCTTCCTCTTCGACTTCT207(ACG)6(CAG)10(GAA)6S82358F:ATTCGTTACGGTCAATTCGCR:AATTCCGTATCCACATTGGC229(TCC)6S92042F:CAGCCTGCAATTGCCTATTTR:TACGAGTGCGAGAAACGAGA139(TC)10S102242F:GAAAAAGGCAAGAGGCGTAAR:GGAATCGTCGAAGAATGGAA280(AT)10S112522F:CGGTGAGTTGCCATTCTTCTR:ATCCGCGCGATATACGTAAC163(CTTC)5S122686F:AAATGGGAATATCCGGGAAGR:ACGTCGAACTCGAGAAGGAG220(CA)10S133249F:ATTTCCTCGTACGACGTTGCR:AAGTCGGTCAGTTGGTCGAT185(CGAC)5S144155F:GTTCGCATGTTGATTGGTTGR:GATGACCGATGACGATGATG126(TTCCA)4S152043F:TTGAGCTCGATCGGAAATCTR:AAATCGACCAATTCCTCCAA111(ATT)16S
此前,本課題組利用RNA-seq技術(shù)對中蜂幼蟲腸道進行深度測序,成功組裝并注釋其參考轉(zhuǎn)錄組。本研究利用生物信息學方法從中蜂幼蟲腸道的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中預(yù)測出多達13448個SSR位點,這些SSR位點種類豐富,以二核苷酸重復類型為主,其次為三核苷酸重復。其它昆蟲如黃粉蟲Tenebriomolitor(朱家穎, 2013)、扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis(羅梅, 2014)和沙蔥螢葉甲Galerucadaurica(張鵬飛, 2016)等的相關(guān)研究結(jié)果顯示單核苷酸重復是最主要的重復類型,其次為三核苷酸重復;溝眶象Eucryptorrhynchuschinensis(武政梅等, 2016)、二點委夜蛾Athetislepigone(Lietal., 2013)及云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(袁遠等, 2014)等昆蟲的SSR以三堿基重復為主。這與本研究的結(jié)果略有不同,以二核苷酸重復類型為主可能是中蜂SSR分子標記的特征。在表達序列標簽(ESTs)中,多數(shù)情況下單核苷酸重復最多,其次為三核苷酸重復。三核苷酸重復是昆蟲EST-SSR 中的核心重復類型,因為三核苷酸核心基元極少產(chǎn)生編碼框滑動突變現(xiàn)象,其在編碼區(qū)較其它重復基元類型更加穩(wěn)定 (Wangetal., 2012)。本研究中,中蜂幼蟲的SSR出現(xiàn)頻率為17.82%,高于溝眶象(武政梅等, 2016)、黑翅土白蟻Odontotermesformosaanus(9.98%)(Huangetal., 2012)及煙粉虱Bemisiatabaci(5.07%)(Xieetal., 2012)等昆蟲中SSR的出現(xiàn)頻率。推測較高的SSR出現(xiàn)頻率是中蜂幼蟲的特征之一。在動植物的轉(zhuǎn)錄組或基因組中,GC/CG是二堿基重復的SSR中的稀有重復基元。本研究發(fā)現(xiàn)GC/CG核心基元數(shù)量僅為1個,與前人研究結(jié)果類似 (張琳琳, 2008;張鵬飛, 2016)。
Tkahashi等(2009)曾通過傳統(tǒng)方法開發(fā)出12個東蜂微衛(wèi)星標記,其中8個具有高多態(tài)性。郭慧萍等(2016)利用8個微衛(wèi)星標記對秦巴山區(qū)17個樣點共979個蜂群的中蜂遺傳多態(tài)性進行評估,并以長白山中蜂和阿壩中蜂作為外群進行種群遺傳分化分析。總體而言,目前已有的中蜂SSR分子標記數(shù)量十分有限,嚴重制約中蜂遺傳進化與種群遺傳研究。本研究中,設(shè)計合成的特異性SSR引物多達21627對,為了驗證上述SSR引物,隨機挑選其中的48對對國內(nèi)5個不同來源的中蜂幼蟲樣品的SSR位點進行PCR擴增,結(jié)果顯示有15對引物可有效擴增出SSR位點,有效擴增率達31.25%,說明基于RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測出的SSR位點只有部分真實存在,然而,通過此法開發(fā)出的可用于多態(tài)性分析的SSR位點數(shù)目仍非??捎^。本研究中,SSR位點擴增產(chǎn)物的電泳采用的是瓊脂糖凝膠法,此法較聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)法分辨率低,上述SSR位點多態(tài)性的確定有待于進一步研究。
綜而述之,利用以RNA-seq為代表的二代測序技術(shù)挖掘SSR分子標記具有通量高、速度快和效率高的優(yōu)點,解決了傳統(tǒng)開發(fā)方法的瓶頸問題,使微衛(wèi)星標記的大規(guī)模開發(fā)成為現(xiàn)實。中蜂是非模式生物,其基因組信息剛剛公布 (Park, 2015),本研究說明基于高通量測序數(shù)據(jù)開發(fā)非模式生物的SSR分子標記是一種快速高效的途徑。目前,以單分子測序技術(shù)為代表的三代測序技術(shù)逐漸興起,SSR分子標記開發(fā)及功能基因定位將更為方便快捷。
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Large-scale development of SSR primers forApisceranaceranalarvae based on its RNA-seq datasets
XIONG Cui-Ling*,ZHANG Lu*,F(xiàn)U Zhong-Min,WANG Hong-Quan,HOU Zhi-Xian,TONG Xin-Yu,LI Wen-Dong,ZHENG Yan-Zhen,CHEN Da-Fu**,GUO Rui**
(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Apisceranaceranais a subspecie ofApiscerana, and it’s also an unique honeybee specie in China. In the present study, SSR molecular markers forA.c.ceranawere predicted based on the transcriptome datasets ofA.c.ceranalarval gut previously obtained. Further, we performed infromation analysis of SSR loci and development of SSR primers. First, MISA software was used to search 43557 unigenes assembled from RNA-seq data of eastern honeybee larval gut, and a total of 13448 SSR loci were found, which distributed in 7763 unigenes. Among these SSR loci, the main repeat types were di-nucleotide repeats (58.03%), followed by tri-nucleotide repeats (28.23%)and finally tetra-nucleotide repeats (9.72%). The AT/AT motif was the most abundant (30.4%)in di-nucleotide repeats. In total, 21627 pairs of primers were designed from all SSRs. 48 pairs of SSR primers were randomly selected and used to amplify the SSR loci inA.c.ceranalarva gut samples from five different regions in China, and 15 SSR primer pairs could amplify the target fragments with expected size. Our findings suggested that large-scale development ofA.c.ceranalarvae’s SSR primers on basis of transcriptome data is feasible, additionally, the 15 SSRs primers developed here can lay a foundation for study on molecular genetics ofA.c.cerana.
RNA-seq;Apisceranacerana; larval gut; SSR
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-45-KXJ7);福建農(nóng)林大學科技發(fā)展資金(KF2015123);國家自然科學基金(30800806)
Received:2016-12-08;接收日期Accepted:2017-01-16
Q963;S891
A
1674-0858(2017)01-068-07
熊翠玲,張璐,付中民,等.基于RNA-seq數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)中華蜜蜂幼蟲的SSR分子標記[J].環(huán)境昆蟲學報,2017,39(1):68-74.
*共同第一作者簡介:熊翠玲,女,1977年生,福建永定人,實驗師,研究方向為蜜蜂保護學,E-mail: pandacl@sina.com;張璐,女,1996年生,河南濮陽人,本科生,研究方向為蜂學,E-mail: m17805949180@163.com
**通訊作者Authors for correspondence, E-mail: fafu_ruiguo@126.com; dfchen826@163.com