陳雪雯 朱紅梅 溫海

(上海市長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科 全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

·論著·

MMP9、S100A10基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)小鼠細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證

陳雪雯 朱紅梅 溫海

(上海市長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科 全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

目的 分別構(gòu)建小鼠MMP9、S100A10沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并驗(yàn)證功能。方法 構(gòu)建能有效干擾S100A10、MMP-9表達(dá)的慢病毒LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA，將其轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增及質(zhì)量檢測(cè)。將包裝好的慢病毒分別轉(zhuǎn)染b.End3，嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過(guò)熒光顯微鏡、RT-qPCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)目的基因表達(dá)量,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。結(jié)果 成功構(gòu)建有效干擾S100A10、MMP-9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，其滴度分別為1×108TU/mL、3×108TU/mL。熒光顯微鏡檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光表達(dá)接近100%；RT-qPCR分別檢測(cè)MMP9、S100A10基因表達(dá)下調(diào)率分別為78%、72%。結(jié)論 構(gòu)建有效干擾S100A10、MMP-9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為控制單一變量直觀探究S100A10、MMP-9影響隱球菌穿過(guò)血腦屏障的能力等研究奠定了重要基礎(chǔ)，為隱球菌性腦炎/腦膜炎的臨床治療靶點(diǎn)研究開(kāi)辟新的思路。

慢病毒載體；基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP9)；S100A10；b.End3

隱球菌病是目前最嚴(yán)重的真菌感染疾病之一，全球每年大概有數(shù)百萬(wàn)人群感染該菌致病，即使治療3個(gè)月仍有624 700例患者死亡[1]。隱球菌有很強(qiáng)的嗜中樞神經(jīng)特性[2-5]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染占以上[6]，由其導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎 (cryptococcal meningitis/meningoencephalitis，CME)，是隱球菌病高病死率的最重要的原因。血腦屏障可以抑制循環(huán)血中大部分分子入腦，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以參與其新陳代謝[7]。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，我們分別構(gòu)建沉默表達(dá)MMP9、S100A10的b.End3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為進(jìn)一步探索隱球菌的嗜中樞神經(jīng)性提供基礎(chǔ)，為臨床防治提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒構(gòu)建相關(guān)材料由上海吉?jiǎng)P生物有限公司提供；小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd3購(gòu)自ATCC；細(xì)胞培養(yǎng)所需胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；熒光顯微鏡為MODEL IX70-S8F2；嘌呤霉素購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。

1.2 方法

MMP9、S100A10引物設(shè)計(jì) GenBank上查找小鼠MMP9、S100A10 cDNA序列，分別是：NM_013599.4、NM_009112.2。CDs區(qū)分別為：39-2231、116-409。利用AlleleID 6.0軟件設(shè)計(jì)基因引物序列，MMP9引物序列為：Forward Primer 5’-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3’,Reverse Primer 5’-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG-3’；S100A10引物序列為：Forward Primer 5’-AGGACCTGAGAGTGCTCATGGAAC-3,Reverse Primer 5’-CTGGAAGCCCACTTTGCCATCTC-3’。利用BLAST比對(duì)，由上海生工生物公司合成。

慢病毒構(gòu)建 慢病毒載體中anti-MMP9-siRNA序列，CTACGATAAGGACGGCAAA。Anti-s100a10-siRNA序列：GGCTTCCAGAGCTTTCTAT。載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b.End3 培養(yǎng) 用含10%胎牛血清 (GIBCO)的DMEN (GIBCO)完全培養(yǎng)液，將細(xì)胞b.End3培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

確定慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MOI和最佳感染條件 將細(xì)胞懸液調(diào)至4×104/mL，100 μL/孔加入96板，按不同施加條件分5組，包括：空白組 (培養(yǎng)基100 μL)、A (培養(yǎng)基90 μL+virus 10 μL)、B (培養(yǎng)基80 μL+polybrene 10 μL+virus 10 μL)、C (ENi.S 90 μL+virus 10 μL)、D (ENi.S 80 μL+polybrene 10 μL+virus 10 μL)，24 h后細(xì)胞匯合率30%時(shí)，即可加入慢病毒，將慢病毒稀釋成5個(gè)濃度梯度，分別為：1×108TU/mL、5×107TU/mL、2×107TU/mL、1×106TU/mL，分別對(duì)應(yīng)MOI值為100、50、20、1。12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡觀察。

確定嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株的濃度 將b.End3 在24孔板以6×104/孔的密度鋪板。孵育過(guò)夜后換液，將配制成0～10 μg/mL (1 μg/mL為區(qū)間)11個(gè)梯度的含嘌呤霉素的培養(yǎng)基分別加入對(duì)應(yīng)孔中，每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，監(jiān)測(cè)細(xì)胞成活比例。

LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA分別轉(zhuǎn)染b.End3 將細(xì)胞懸液調(diào)至4×104/mL，500 μL/孔加入24孔板，24 h后將空載慢病毒 (NC)、LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA調(diào)成MOI為20的病毒液所需體積[體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)目)/病毒滴度]，按照事先確定的轉(zhuǎn)染條件換液。培養(yǎng)12 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基。

篩選穩(wěn)定株 病毒轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞約長(zhǎng)至80%～90%，用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基孵育，篩選4次，之后用含0.1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持。

RT-qPCR分別檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系MMP9、S100A10的基因表達(dá) 將篩選4次后的細(xì)胞鋪板，將6孔板鋪滿90%，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用TopGreen qPCR Super Mix行qPCR檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡確定轉(zhuǎn)染條件

細(xì)胞生長(zhǎng)良好，感染效率在80%左右所對(duì)應(yīng)的感染條件為：ENi.S 90 μL+virus 10 μL，MOI為20，慢病毒濃度為2×107TU/mL (見(jiàn)圖1)。

2.2 制備篩選培養(yǎng)基

24孔板的b.End3在含1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，可在第4天殺滅所有細(xì)胞，故將此濃度定為篩選培養(yǎng)基的藥物濃度。

2.3 表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果

LV-musMMP9-shRNA：ccgggaCTACGATA

AGGACGGCAAActcgagTTTGCCGTCCTTATC

GTAGtctttttg

LV-musS100A10-shRNA：ccggGGCTTCCA

GAGCTTTCTATctcgagATAGAAAGCTCTGGA

AGCCtttttg

上述結(jié)果與將各自靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的短發(fā)夾RNA (shRNA)，根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)引入Age I和EcoR I酶切位點(diǎn)的序列一致。

2.4 b.End3細(xì)胞形態(tài)觀察

b.End3細(xì)胞購(gòu)自ATCC，在含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ) (見(jiàn)圖2)。

2.5 熒光顯微鏡檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率

本實(shí)驗(yàn)所用慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白序列，明暗場(chǎng)在同一視野下，產(chǎn)生綠色熒光說(shuō)明該細(xì)胞已被成功轉(zhuǎn)染目的序列，且綠色熒光蛋白表達(dá)越多，轉(zhuǎn)染率越高 (見(jiàn)圖3～5)。

2.6RT-qPCR分別檢測(cè)MMP9、S100A10基因表達(dá)

沉默MMP9的b.End3，MMP9的敲減效率達(dá)78.8% (見(jiàn)圖6)，經(jīng)S-N-K檢驗(yàn)，認(rèn)為慢病毒沉默MMP9的b.End3細(xì)胞與NC組、b.End3組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，而b.End3組與NC組的MMP9表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。沉默S100A10的b.End3，S100A10的敲減效率達(dá)76.0% (見(jiàn)圖7)，經(jīng)S-N-K檢驗(yàn)，認(rèn)為慢病毒沉默S100A10的b.End3細(xì)胞與NC組、b.End3組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，而b.End3組與NC組的MMP9表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b.End3轉(zhuǎn)染條件下的明視野和暗視野觀察結(jié)果 (ENi.S 90 μL+virus 10 μL，其中慢病毒濃度為2×107TU/mL) 圖2 顯微鏡下小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3的體外培養(yǎng)結(jié)果 (a.10×，b.40×) 圖3 LV-musMMP9-shRNA b.End3的暗視野和明視野 圖4 LV-musS100A10-shRNA b.End3的暗視野和明視野 圖5 LV-NC-shRNA b.End3的暗視野和明視野 圖6 b.End3、NC、LV-musMMP9-shRNA b.End3 3種細(xì)胞MMP9表達(dá)量比較 圖7 b.End3、NC、LV-musS100A10-shRNA b.End3 3種細(xì)胞MMP9表達(dá)量比較

Fig.1 Observation of b.End3 from Bright field & Dark field after transfection (ENi.S 90 μL+virus 10 μL，concentration of lentivirus is 2×107TU/mL) Fig.2 The observation of b.End3 (a.10×,b.40×) Fig.3 The observation of Bright field & Dark field of LV-musMMP9-shRNA b.End3 Fig.4 The observation of Bright field & Dark field of LV-musS100A10-shRNA b.End3 Fig.5 The observation of Bright field & Dark field of LV-NC-shRNA b.End3 Fig.6 The expression quantity of MMP9 from b.End3,NC and LV-musMMP9-shRNA b.End3 Fig.7 The expression quantity of S100A10 from b.End3,NC and LV-musS100A10-shRNA b.End3

3 討 論

目前，隱球菌性腦膜炎在免疫未見(jiàn)異常的人群中發(fā)病率逐年增高，隱球菌強(qiáng)烈的嗜中樞神經(jīng)性是探索該疾病病理生理機(jī)制的突破口，而其通過(guò)血腦屏障的機(jī)制是關(guān)鍵。

血腦屏障可以抑制循環(huán)血中大部分分子入腦，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以參與其新陳代謝[7]。若隱球菌能作用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，就能穿透血腦屏障并且侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8]。

S100A10蛋白，是一種纖溶酶原調(diào)節(jié)蛋白，是鈣結(jié)合蛋白家族中的S100蛋白家族中的一員，可與膜聯(lián)蛋白A2 (annexin A2)結(jié)合形成異四聚體 (S100A10)2-(annexinA2)2，作為膜蛋白存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上，與細(xì)胞的胞吞胞吐、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等密切相關(guān)。異四聚體 (S100A10)2-(annexinA2)2可使纖溶酶原被tPA (組織型纖溶酶原激活劑)、uPA (尿激酶型纖溶酶原激活劑)激活為纖溶酶，其可降解細(xì)胞基質(zhì)，間接激活MMP9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9)，促使病原穿過(guò)基底膜[9]。腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)菌和真菌因該纖溶酶原系統(tǒng)增強(qiáng)其侵襲或遷移能力。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，小鼠在創(chuàng)傷應(yīng)激后，前額葉的S100A10蛋白表達(dá)增加；Rand等[11]發(fā)現(xiàn)在腦室管膜腫瘤復(fù)發(fā)病例中，S100A10表達(dá)水平上升非常明顯。我們前期實(shí)驗(yàn)證明[12]，新生隱球菌B3501與b.End3共孵育后，S100A10蛋白表達(dá)增加。

既往研究顯示，S100A10下調(diào)的巨噬細(xì)胞纖溶酶表達(dá)減少，pro-MMP9活化減少[13]。MMP-9蛋白，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶MMPs中的一員，體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞不儲(chǔ)備MMPs，在需要MMPs信號(hào)傳遞到細(xì)胞后臨時(shí)合成，并以無(wú)活性的酶原形式分泌到胞外[14]，主要分解Ⅳ型基質(zhì)蛋白，MMPs與血腦屏障開(kāi)放[15]有關(guān)。Tang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用慢病毒下調(diào)小鼠B16細(xì)胞MMP9蛋白表達(dá)，其黑素瘤侵襲能力明顯下降。血腦屏障基底膜主要成分為Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白和微纖維蛋白，MMP9可降解微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白o(hù)ccludin、基底膜Ⅳ型基質(zhì)蛋白，也同時(shí)能被緊密連接蛋白claudins激活[17]，促進(jìn)病原體從脈管系統(tǒng)向周緣組織侵襲[18]。故本實(shí)驗(yàn)探索下調(diào)b.End3 的S100A10表達(dá)是否可引起MMP9表達(dá)或功能改變，可進(jìn)一步查看MMP9是否在隱球菌跨越血腦屏障過(guò)程中發(fā)揮相應(yīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，是真菌致病機(jī)制研究方面的創(chuàng)新，構(gòu)建有效干擾S100A10、MMP-9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，以單一變量為控制，直觀探究S100A10、MMP-9影響隱球菌穿過(guò)血腦屏障的能力。慢病毒是一種以人類(lèi)免疫缺陷I型病毒 (HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。De Ravin等[19]曾用慢病毒造血干細(xì)胞移植基因成功治療5例SCID-X1連鎖的免疫功能紊亂。與腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒有以下優(yōu)點(diǎn)：其能夠?qū)⒉《境休d的基因整合到宿主基因組后長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，具有低免疫原性，制作動(dòng)物模型的基因下調(diào)可達(dá)50%以上，可用四環(huán)素類(lèi)藥物誘導(dǎo)；此外，下調(diào)目的基因表達(dá)同時(shí)，不產(chǎn)生額外有效的免疫應(yīng)答，不產(chǎn)生可見(jiàn)的病理學(xué)現(xiàn)象，可保證本課題組實(shí)驗(yàn)的單一變量原則。同時(shí)，構(gòu)建所得細(xì)胞能穩(wěn)定傳代，方便實(shí)驗(yàn)重復(fù)，故本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒作為載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是方便、可行、可信的。

本實(shí)驗(yàn)中，將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系鋪板孵育過(guò)夜，熒光顯微鏡下可見(jiàn)兩種慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)可達(dá)100%，RT-qPCR檢測(cè)顯示，NC組MMP9與S100A10表達(dá)有所下調(diào)，但與正常細(xì)胞組比較，這兩者表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)，說(shuō)明b.End3轉(zhuǎn)染空載病毒對(duì)細(xì)胞本身的影響的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可以使用NC b.End3作為空白對(duì)照。而轉(zhuǎn)染組與空載慢病毒NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，下調(diào)率分別為78.8%、76.0%?？梢?jiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染的b.End3可穩(wěn)定沉默目的基因表達(dá)，細(xì)胞系篩選成功，為進(jìn)一步探究b.End3細(xì)胞沉默S100A10、MMP-9表達(dá)后如何影響隱球菌通過(guò)體外血腦屏障的能力等研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)于隱球菌性腦膜炎的基礎(chǔ)研究，研究者關(guān)注點(diǎn)多集中于菌種探究，而本研究立足于疾病本身并著眼于宿主，根據(jù)基因芯片的前期相關(guān)結(jié)果，分別利用慢病毒構(gòu)建能有效干擾S100A10、MMP-9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，以其控制單一變量應(yīng)用于隱球菌性腦炎/腦膜炎的研究，在方法學(xué)上是一種創(chuàng)新，從結(jié)果看，它能直觀判斷感染源與宿主作用后目的蛋白的改變，有利于將結(jié)果更快更好地預(yù)測(cè)臨床。

[1] Park BJ,Wannemuehler KA,Marston BJ,et al.Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS[J].AIDS,2009,23(4):525-530.

[2] Casadevall A,Perfect JR.Cryptococcusneoformans[M].1st edition.American Society for Microbiology,Washington,DC:ASM Press,1998.

[3] Subramanian S,Mathai D.Clinical manifestations and management of cryptococcal infection[J].J Postgrad Med,2005,51(Suppl 1):S21-S26.

[4] Lambertucci JR,Franco R,de Queiroz LC.Cryptococcal meningoencephalitis and pulmonary nodule in a non-HIV-infected immunocompetent patient[J].Rev Soc Bras Med Trop,2005,38(2):207-208.

[5] Drouet A,Amah Y,Pavic M,et al.Subacute meningoradiculomyeloencephalitis due to cryptococcosis infection[J].Rev Med Interne,2005,26(5):403-408.

[6] Pukkila-Worley R,Mylonakis E.Epidemiology and management of cryptococcal meningitis:developments and challenges[J].Expert Opin Pharmacother,2008,9(4):551-560.

[7] Barros LF,Bittner CX,Loaiza A,et al.A quantitative overview of glucose dynamics in the gliovascular unit[J].Glia,2007,55(12):1222-1237.

[8] Tseng HK,Huang TY,Wu AY,et al.HowCryptococcusinteracts with the blood-brain barrier[J].Future Microbiol,2015,10(10):1669-1682.

[9] O'Connell PA,Surette AP,Liwski RS,et al.S100A10 regulates plasminogen-dependent macrophage invasion[J].Blood,2010,116(7):1136-1146.

[10] Zhang L,Li H,Su TP,et al.p11 is up-regulated in the forebrain of stressed rats by glucocorticoid acting via two specific glucocorticoid response elements in the p11 promoter[J].Neuroscience,2008,153(4):1126-1134.

[11] Rand V,Prebble E,Ridley L,et al.Investigation of chromosome 1q reveals differential expression of members of the S100 family in clinical subgroups of intracranial paediatric ependymoma[J].Br J Cancer,2008,99(7):1136-1143.

[12] 李平.甘露糖受體MR參與隱球菌免疫逃逸及S100A10促進(jìn)隱球菌穿過(guò)血腦屏障的機(jī)制研究[D].第二軍醫(yī)大學(xué),2013.

[13] O'Connell PA,Surette AP,Liwski RS,et al.S100A10 regulates plasminogen-dependent macrophage invasion[J].Blood,2010,116(7):1136-1146.

[14] Vandooren J,Van den Steen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9):the next decade[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(3):222-272.

[15] Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2):104-112.

[16] Tang ZY,Liu Y,Liu LX,et al.RNAi-mediated MMP-9 silencing inhibits mouse melanoma cell invasion and migrationinvitroandinvivo[J].Cell Biol Int,2013,37(8):849-854.

[17] Lohmann C,Krischke M,Wegener J,et al.Tyrosine phosphatase inhibition induces loss of blood-brain barrier integrity by matrix metalloproteinase-dependent and-independent pathways[J].Brain Res,2004,995(2):184-196.

[18] Stie J,Bruni G,Fox D.Surface-associated plasminogen binding ofCryptococcusneoformanspromotes extracellular matrix invasion[J].PLoS ONE,2009,4(6):e5780.

[19] De Ravin SS,Wu X,Moir S,et al.Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency[J].Sci Transl Med,2016,8(335):335ra57.

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Construction and verification of stable down-regulated MMP9,S100A10 mouse brain microvascular endothelial cell lines

CHEN Xue-wen,ZHU Hong-mei,WEN Hai

(PLAKeyLaboratoryofFungalDiseasesandShanghaiKeyLaboratoryofMolecularMedicalMycology,DepartmentofDermatology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Objective To construct stable down-regulated MMP9,S100A10 mouse brain microvascular endothelial cell lines,then verify the reduction level of gene expression.Methods By transfecting LV-musMMP9-shRNA,LV-musS100A10-shRNA into b.End3 respectively,then the very cell lines were screened by puromycin.The obtained differential b.End3 cell lines were observed by fluorescence microscope and varified by RT-qPCR.Results The study successfully constructed stable transfected cell lines which could effectively interference S100A10,MMP-9 expression of 3×108TU/mL and 1×108TU/mL LV-musS100A10-shRNA respectively.Conclusions The targeted down-regulation b.End3 cell lines are useful for further exploring the role of molecule S100A10 or MMP-9 in host blood-brain barrier by control variables and the possible target of treatment exploration of cryptococcal encephalitis/meningitis.

Lentivirus vector；MMP9；S100A10；b.End3

19-22]

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31470252，81271800，31270181)

陳雪雯，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:snowflychen@163.com

溫海,E-mail:wenhaipfk@126.com;朱紅梅,E-mail:hmzhu_cn@163.com90%

R 392.1

A

1673-3827(2017)12-0019-04

2016-10-16