施高翔 汪云霞 馮鑫 邵菁 汪天明 汪長(zhǎng)中

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥 230038;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230038)

·論著·

白頭翁湯正丁醇提取物誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡

施高翔1，2汪云霞1，2馮鑫1，2邵菁1，2汪天明1，2汪長(zhǎng)中1，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥 230038;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，合肥 230038)

目的 探討白頭翁湯正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB)對(duì)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡的影響。方法 分別以DCFH-DA染色和JC-1染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白念珠菌生物被膜細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS)水平和線粒體膜電位 (MMP)變化；Annexin V-FITC/PI染色染色熒光顯微鏡觀察白念珠菌生物被膜細(xì)胞磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine，PS)外翻并檢測(cè)凋亡率；FITC-VAD-FMK染色觀察白念珠菌生物被膜細(xì)胞metacaspase活性；DAPI染色觀察白念珠菌生物被膜細(xì)胞核形態(tài)。結(jié)果 ≥128 μg/mL BAEB處理后白念珠菌生物被膜細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高，線粒體膜電位顯著降低，PS外翻增加，凋亡率明顯升高，metacaspase酶活性顯著升高，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮和碎裂。結(jié)論 白頭翁湯正丁醇提取物可誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡。

白頭翁湯正丁醇提取物；白念珠菌；生物被膜；凋亡

白念珠菌是存在于人體皮膚或腔道的一種條件致病性真菌，當(dāng)長(zhǎng)期使用抗生素造成機(jī)體菌群失調(diào)，或使用免疫抑制劑及患有艾滋病等疾病造成抵抗力下降時(shí)，白念珠菌即可致病[1-2]。目前臨床上常用的抗真菌藥物不僅種類少、毒副作用較大，且容易產(chǎn)生耐藥性。日漸嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象已成為抗真菌治療最棘手的問題，而耐藥主要原因之一在于真菌生物被膜的形成[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯正丁醇提取物 (Butyl alcohol exertact of Bai Tou Weng decoction,BAEB)對(duì)白念珠菌生物被膜形成具有較強(qiáng)的抑制作用[4]，但BAEB是否能通過促進(jìn)凋亡方式來抑制生物被膜尚不明確。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討B(tài)AEB對(duì)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡的影響，為其抗白念珠菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌C.albicansSC5314，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)。

藥物 白頭翁湯按國(guó)家中醫(yī)藥管理局統(tǒng)一組織編審的普通高等類教育中醫(yī)類規(guī)劃教材《方劑學(xué)》中的藥物 (白頭翁、黃柏、黃連、秦皮)組成，購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)鑒定。使用80%乙醇70℃回流3 h后過濾，收集濾渣，共重復(fù)回流3次后，濾液用正丁醇按照極性梯度萃取3次，萃取液65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至結(jié)晶干燥，得到白頭翁湯正丁醇提取物；兩性霉素B (博美生物科技)。

試劑 PBS緩沖液 (pH 7.0±2.0)；二甲基亞砜 (Dimethyl Sulphoxide，DMSO，國(guó)藥集團(tuán))；RPMI-1640培養(yǎng)基 (life technologies公司)；DAPI (Sigma公司)；蝸牛酶 (Sigma公司)；AnnexinV/FITC試劑盒 (上海貝博生物)；FITC-VAD-FMK (Promega公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒 (Solarbio公司)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 (Solarbio公司)。

儀器 恒溫培養(yǎng)箱 (上海博迅實(shí)業(yè)公司)；流式細(xì)胞儀 (Flow Cytometer，BD Accuri C6)；倒置熒光顯微鏡 (Olympus IX81，Japan)。

2 方 法

2.1 白念珠菌的活化及菌液的配制[5]

用接種環(huán)從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取C.albicansSC5314單菌落接種于沙氏液體培養(yǎng)基中，35℃搖床過夜培養(yǎng)，使白念珠菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，PBS洗2次后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)基將菌液稀釋到2×106CFU/mL備用。

2.2 白念珠菌生物被膜細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)及脫壁處理獲取[6-7]

將2 mL (濃度為2×106CFU/mL)的菌懸液接種于24孔培養(yǎng)板，同時(shí)將2 mL白頭翁湯正丁醇提取物 (終濃度256、128、64 μg/mL)分別加入孔板中，另設(shè)不加藥的空白組和陽性對(duì)照藥兩性霉素B (0.5 μg/mL)，37℃靜置孵育16 h，無菌PBS洗2次，然后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行脫壁處理：加脫壁促進(jìn)劑 (50 mmol/L K2HPO4，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT)，37℃、100 r/min搖床孵育30 min，無菌PBS緩沖液洗2次后，轉(zhuǎn)移至1.5%蝸牛酶溶液中，30℃、100 r/min搖床孵育45 min，無菌PBS緩沖液洗2次后，得脫壁的原生質(zhì)體狀態(tài)的白念珠菌。

2.3 AnnexinV-FITC/PI染色[8]

將經(jīng)上述藥物凋亡誘導(dǎo)并經(jīng)過脫壁處理的C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞用無菌PBS洗2次，以400 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加5 μL Annexin V-FITC染液，輕輕混勻后于4℃避光孵育15 min，對(duì)細(xì)胞膜上的PS進(jìn)行標(biāo)記；再加入10 μL PI染液混勻繼續(xù)孵育5 min，對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色。于熒光顯微鏡觀察PS外翻情況并拍照，同時(shí)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

2.4 Caspase活性的測(cè)定[9]

將經(jīng)上述藥物凋亡誘導(dǎo)并經(jīng)過脫壁處理的C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，無菌PBS洗3次，加100 μL的10 μmol/L的FITC-VAD-FMK于30℃避光染色1 h，均勻涂布在含有多聚賴氨酸的載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 DAPI染色

將上述藥物凋亡誘導(dǎo)并經(jīng)過脫壁處理的C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞以70%乙醇固定滲透10 min，3 000 r/min離心5 min收集，無菌PBS緩沖液洗2次后加入10 μg/mL的DAPI，室溫避光染色20 min。取20 μL菌懸液置于含有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫黏附5 min后，再用10%甲醛固定10 min，以無菌PBS緩沖液輕洗3次后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧 (reactive oxygen species，ROS)

在脫壁的原生質(zhì)體菌懸液中，按照試劑盒說明書加入DCFH-DA試劑，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和生物被膜細(xì)胞充分接觸。再以PBS洗滌細(xì)胞3次后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCFH-DA的熒光強(qiáng)度，該值代表ROS水平。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 (mitochondrial membrane exponential，MMP)

參照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說明書加入JC-1試劑，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min后，吸除上清，用其染色緩沖液洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)生物被膜細(xì)胞線粒體膜電位 (MMP)水平。

計(jì)量資料以 (均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，所有數(shù)據(jù)使SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，組間差異比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BAEB可顯著提高白念珠菌生物被膜細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

本實(shí)驗(yàn)用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 (見圖1)，相比于空白組 (0.7%陽性率)，64、128、256 μg/mL BAEB和0.5 μg/mL AmB干預(yù)后，可提升1.5%、2.8%、5.1%和11.5%的活性氧水平 (P<0.05)。

3.2 BAEB可顯著降低白念珠菌生物被膜細(xì)胞線粒體膜電位 (MMP)

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變 (FL2/FL1的比值)可檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 (見圖2)，與空白組FL2/FL1值 (2.8)相比較，0.5 μg/mL AmB使FL2/FL1降低為1.06、64、128和256 μg/mL BAEB,能劑量依賴性的降低白念珠菌生物被膜細(xì)胞內(nèi)的膜電位，F(xiàn)L2/FL1值分別為2.01、1.81和1.63 (P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BAEB對(duì)C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞ROS的影響 (*.P<0.05)：A.空白組，B.0.5 μg/mL AmB，C.64 μg/mL BAEB，D.128 μg/mL BAEB，E.256 μg/mL BAEB 圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BAEB對(duì)C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞MMP的影響 (*.P<0.05)

Fig.1 Flow cytometric analysis of ROS accumulation in BAEB treatedC.albicansSC5314 biofilms cells with DCFH-DA staining (*.P<0.05) Fig.2 Flow cytometric analysis of MMP accumulation in BAEB treatedC.albicansSC5314 biofilm cells with JC-1 staining (*.P<0.05)

3.3 BAEB可誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞PS外翻和增加凋亡率

PS外翻是真菌凋亡的表現(xiàn)形式之一。PS在正常情況下分布于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。Annexin V (膜聯(lián)蛋白)可以與暴露在膜外側(cè)的PS特異性結(jié)合，利用熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Application of a bias correction scheme for 2-meter temperature levels over complex terrain

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，空白對(duì)照組的細(xì)胞有少量的綠色熒光，且有紅色的熒光，陽性對(duì)照藥AmB組綠色熒光細(xì)胞最多。經(jīng)BAEB處理后的細(xì)胞中，隨著藥物濃度的升高，綠色熒光細(xì)胞數(shù)量越多。表明PS已經(jīng)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，提示BAEB導(dǎo)致生物被膜細(xì)胞的凋亡。

同時(shí)，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)BAEB對(duì)生物被膜細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) (見圖4)，相比于空白組凋亡率 (1.4%)，64、128、256 μg/mL BAEB和0.5 μg/mL AmB可引起3.7%、5.1%、8.3%和13.0%的白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡 (P<0.05)。

圖3 熒光顯微鏡觀察BAEB對(duì)C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞磷脂酰絲氨酸 (PS)外翻的影響 圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BAEB對(duì)C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞凋亡率的影響 (*.P<0.05)：A.空白組，B.0.5 μg/mL AmB，C.64 μg/mL BAEB，D.128 μg/mL BAEB，E.256 μg/mL BAEB

Fig.3 Phosphatidylserine externalization recorded by fluorescence microscopic with Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicansdispersion cells of biofilms (×400):A-E.Phase cotrast;a-e.Annexin V;A,a.Control;B,b.0.5 μg/mL AmB;C,c.64 μg/mL BAEB;D,d.128 μg/mL BAEB;E,e.256 μg/mL BAEB Fig.4 Flow cytometric analysis with FITC-labeled Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms cells (*.P<0.05)

3.4 BAEB可激活白念珠菌生物被膜細(xì)胞metacaspase活性

Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，主要負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。在C.albicans細(xì)胞中，存在Caspase同源結(jié)構(gòu)類似物metacaspase，因此，在實(shí)驗(yàn)中選用FITC-VAD-FMK在原位檢測(cè)metacaspase的活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示?？瞻讓?duì)照組中見有極其微弱熒光的細(xì)胞。BAEB處理后的細(xì)胞，大部分被標(biāo)記上明亮的綠色熒光，陽性對(duì)照藥AmB的熒光亮度最為明顯，說明BAEB激活了C.albicansSC5314細(xì)胞內(nèi)的metacaspase。

3.5 BAEB可誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞核碎裂

DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。這種染料可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈結(jié)合而產(chǎn)生熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。正常對(duì)照組的白念珠菌呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，經(jīng)BAEB處理過的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的核固縮或顆粒狀熒光，正常的細(xì)胞出現(xiàn)均勻一致的熒光密度，而凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯濃縮、核碎裂等現(xiàn)象。

4 討 論

白念珠菌生物被膜是白念珠菌附著于活體組織或非活體組織表面、由自身產(chǎn)生的胞外多聚基質(zhì)包裹的有特定結(jié)構(gòu)和功能的聚合體，是菌體在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中所表現(xiàn)出的為適應(yīng)環(huán)境壓力的另一種生存方式[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在難治性真菌感染的病灶中多存在生物被膜感染源。生物被膜的形成會(huì)使病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性降低，即產(chǎn)生耐藥性。因此，如何控制生物被膜對(duì)于防治白念珠菌感染具有重要意義。

圖5 熒光顯微鏡觀察BAEB對(duì)C.albicansSC5314生物被膜細(xì)胞metacaspase酶活性的影響：a.空白組，b.0.5 μg/mL AmB，c.64 μg/mL BAEB，d.128 μg/mL BAEB，e.256 μg/mL BAEB (×400) 圖6 熒光顯微鏡觀察BAEB干預(yù)后C.albicansSC5314細(xì)胞核碎裂

Fig.5 Metacaspase activity observed by Fluorescence microscopic with FITC-VAD-FMK staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms (×400) Fig.6 Nuclear damages recorded by Fluorescence microscopic with DAPI staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms (×400):A-E.Phase cotrast;a-e.DAPI;A,a.Control;B,b.0.5 μg/mL AmB;C,c.64 μg/mL BAEB;D,d.128 μg/mL BAEB;E,e.256 μg/mL BAEB

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主有序的死亡，是生物體普遍存在的過程。誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡不僅是治療腫瘤的重要策略[11]，對(duì)抗真菌研究也有一定的借鑒意義。白念珠菌是單細(xì)胞真菌，對(duì)于其凋亡現(xiàn)象的研究目前較少。但近年來已發(fā)現(xiàn)，包括白念珠菌在內(nèi)的真菌在某些因素的誘導(dǎo)下可以發(fā)生凋亡。Phillips等[12]最初觀察到，乙酸在適當(dāng)濃度下可誘導(dǎo)白念珠菌凋亡。AL-Dhaheri RS等[13]發(fā)現(xiàn)，兩性霉素B干預(yù)后白念珠菌生物被膜細(xì)胞也出現(xiàn)凋亡。白念珠菌及其生物被膜細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，表明有望通過藥物 (包括中藥)誘導(dǎo)病原真菌的凋亡可能成為抗真菌的新策略。

中藥復(fù)方白頭翁湯由白頭翁、黃柏、黃連、秦皮組成。白頭翁入肝經(jīng)，治療厥陰濕熱，為方中主藥；秦皮亦入肝經(jīng)，清熱解毒，同時(shí)配合黃連、黃柏清熱殺蟲相得益彰，四藥相伍協(xié)同作用治療肝經(jīng)濕熱型念珠菌性陰道炎效果顯著[14]。近年來，課題組對(duì)該復(fù)方采用多種溶劑萃取得到相應(yīng)的提取物，經(jīng)比較證實(shí)白頭翁湯正丁醇提取物 (BAEB)抗白念珠菌的活性最強(qiáng)，可顯著抑制白念珠菌其生物被膜的形成[15]，為本文進(jìn)一步研究白頭翁湯正丁醇提取物誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BAEB可顯著提升白念珠菌生物被膜細(xì)胞內(nèi)ROS的累積，降低MMP；Annein-V染色結(jié)果中表明，BAEB可誘導(dǎo)C.albicansSC5314磷脂酰絲氨酸外翻，而PS的外翻正是細(xì)胞凋亡的典型征兆之一。同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明，BAEB可顯著增加白念珠菌生物被膜細(xì)胞的凋亡率，另經(jīng)FITC染色的結(jié)果證明，BAEB激活了C.albicansSC5314細(xì)胞內(nèi)的metacaspase；經(jīng)DAPI染色的結(jié)果證明，BAEB促使白念珠菌生物被膜細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的核固縮、核碎裂或顆粒狀熒光等現(xiàn)象，這些都是凋亡的明顯特征。

綜上，本研究首次報(bào)道BAEB可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗白念珠菌生物被膜作用，為白頭翁湯在臨床上治療白念珠菌生物被膜感染提供了重要依據(jù)，但其更深入的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步揭示。

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[本文編輯] 施 慧

Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction induced apoptosis inCandidaalbicansbiofilms

SHI Gao-xiang1，2,WANG Yun-xia1，2,FENG Xin1，2,SHAO Jing1，2,WANG Tian-ming1，2,WANG Chang-zhong1，2

(1.SchoolofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230038，China;2.InstituteofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiAcademyofChineseMedicine，Hefei230038，China)

Objective To explore the Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction effect on apoptosis ofCandidaalbicansbiofilms.Methods Using DCFH-DA staining flow cytometry to detectCandidaalbicansbiofilm cells of reactive oxygen species (ROS) level;Using JC-1 staining of mitochondria ofCandidaalbicansbiofilm membrane flow cytometry to detect MMP;Phosphatidylserine externalization was recorded by fluorescence microscopic with Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicanscells of biofilms;Metacaspase activity was observed by Fluorescence microscopic with FITC-VAD-FMK staining at the early stage of apoptosis inC.albicanscells of biofilms;Observation onCandidaalbicansbiofilm morphology was performed by DAPI nuclear staining and fluorescence microscopy.Results The apoptosis ofCandidaalbicanssignificantly increased the proportion of more than 128 ug mL-1BAEB treatment,Caspase activity increased,nuclear pyknosis and fragmentation were observed.Intracellular ROS level was significantly increased,mitochondrial membrane potential decreased significantly.Conclusion The Butyl alcohol extract of BaiTou Weng decoction of certain concentrations could induce apoptosis ofCandidaalbicansbiofilm cells.

Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction;C.albicans;biofilms;apoptosis

13-18]

施高翔，男 (漢族)，碩士，助教.E-mail:ssjlsgx@163.com

汪長(zhǎng)中,E-mail:ahwcz63@sina.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0013-06

2016-11-23