薛曉蓉，楊桂梅，胡寧璽，馬元梅，張 楠

（青海省家畜改良中心，青海西寧 810016）

藏獒精液稀釋液的篩選實驗

薛曉蓉，楊桂梅，胡寧璽，馬元梅，張 楠

（青海省家畜改良中心，青海西寧 810016）

為探討藏獒精液稀釋的最佳稀釋液配方，本試驗選取近年來常用的稀釋液中主要營養(yǎng)成分，根據(jù)不同比例添加量，組成8種藏獒精液稀釋液配方進(jìn)行對比試驗，分析不同稀釋液配方對藏獒精液稀釋效果的影響。結(jié)果表明：藏獒精液保存在稀釋液配方6中效果最佳，配方6中精子活力和頂體完整率高于其他7個配方，差異顯著（P＜0.05）。

藏獒；精液稀釋液；篩選

藏獒是原產(chǎn)于中國青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)的大型猛犬,屬于世界珍稀犬種之一[1]。由于原產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境和藏族牧民生活方式改變，逐漸忽視了對藏獒的選擇和培育，導(dǎo)致大部分個體因品種混雜而失去了原有的遺傳特色，加之大量藏獒外銷，純種藏獒的種群數(shù)量減少，品種基因流失，種質(zhì)資源受到嚴(yán)重破壞[2]。因此，本實驗旨在通過對藏獒精液冷凍稀釋液進(jìn)行篩選，制作冷凍精液，為藏獒人工受精、擴(kuò)繁及優(yōu)良品種資源保護(hù)提供依據(jù)。

精液的稀釋是指在精液中添加一定數(shù)量的適宜于精子存活并保持其受精能力的溶液，添加的溶液稱為稀釋液。只有經(jīng)過稀釋的精液才適于保存、運輸和輸精，因此精液的稀釋是藏獒進(jìn)行人工受精的一個重要技術(shù)環(huán)節(jié)。精液稀釋的目的在于擴(kuò)大精液的容量，增加與配母獒數(shù)，降低精液能量消耗，補(bǔ)充適當(dāng)營養(yǎng)和保護(hù)物質(zhì)，延長精子的壽命，有利于精子的冷凍和保存。所采用稀釋液的pH、滲透壓必須滿足精子生存條件，并能為精子提供營養(yǎng)物質(zhì)。本實驗通過比較不同稀釋液對藏獒精液保存的效果，以篩選最佳稀釋液。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇青海省家畜改良中心藏獒養(yǎng)殖基地所提供的9頭優(yōu)秀種公獒，進(jìn)行手握法采精。種公獒的飼養(yǎng)管理及散放訓(xùn)練按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 稀釋液的篩選與配制 參考國內(nèi)外相關(guān)報道，實驗選擇了8種稀釋液配方，分別為配方1、2、3、4、5、6、7、8，具體配方見表1。按實驗需要和稀釋液配方中的比例稱取表1中各種物質(zhì)，溶于蒸餾水中。取新鮮雞蛋，用75%酒精給蛋殼消毒，敲破蛋殼，去掉蛋清，把包有完整卵黃膜的卵黃放在干凈的濾紙上，用濾紙吸于卵黃膜的蛋清，持干凈注射器刺破卵黃膜，抽取卵黃，用4層濾紙過濾，然后按所需要量把卵黃加入配好的溶液中，搖勻，離心20 min。取上清液加入青霉素、鏈霉素。將各個稀釋液一分為二，分別為Ⅰ液和Ⅱ液(添加不同濃度甘油）。Ⅰ液用于鮮精的1∶1稀釋。Ⅱ液置于低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫褚旱南♂尵浩胶? h后加入。

1.3 公獒精液的液態(tài)保存 藏獒精液分別用上述8種稀釋液（Ⅰ液）作1∶1稀釋，分裝于滅菌的試管內(nèi)，置于18℃的恒溫箱內(nèi)保存，每隔4 h檢測1次，分析比較8種稀釋液（Ⅰ液）對精子活力的影響。

1.4 藏獒精液的冷凍保存

1.4.1 精子活力檢查 相差顯微鏡檢查精子活力，活力達(dá)60%以上的精液留于備用；活力達(dá)不到60%的精液則淘汰。

1.4.2 精子密度測定 經(jīng)評定精子活力達(dá)60%的精液，用卡蘇精子密度測定儀測定藏獒精子密度（以2 000萬個精子/mL），能讀出精液的密度及相應(yīng)的稀釋液添加量和預(yù)凍支數(shù)。

表1 不同稀釋液的配方

1.4.3 精液的稀釋、降溫和平衡 根據(jù)密度儀上讀取的稀釋液添加量分別加入8種稀釋液Ⅰ液，然后在冰箱內(nèi)平衡2 h后加Ⅱ液。冷凍前將精液按照精液品質(zhì)檢測方法進(jìn)行檢查，并做好記錄。

1.4.4 精液的細(xì)管封裝與冷凍 平衡后的精液用卡蘇細(xì)管封裝打印一體機(jī)及程控冷凍儀進(jìn)行封裝和冷凍。

1.4.5 精液的解凍 取出已冷凍的細(xì)管樣本，置于39℃的水浴鍋中，水平搖晃溶解10 s后取出，擦拭細(xì)管外壁水珠后按精液品質(zhì)檢測方法進(jìn)行常規(guī)檢查并做好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液對藏獒精液液態(tài)保存效果的影響

2.1.1 精子在不同稀釋液配方中的存活時間 由表2可知，藏獒的精子活力在稀釋液中液態(tài)保存的情況下，活力隨著時間的增加而減少，說明藏獒精液的輸精應(yīng)盡早進(jìn)行，防止由于時間過長而造成精子活力下降，導(dǎo)致母獒的受孕率或產(chǎn)仔數(shù)減少。

2.1.2 不同稀釋液中精子活力大于0.3的存活時間由表3可知，精液在18℃條件下保存，使用配方4、6、7、8，在精子活力0.3以上的存活時間都長于配方1、2、3、5（P ＜0.05），其中配方6保存時間最長，為（32.1±3.0）h，顯著高于其他7種稀釋液（P＜0.05）。

2.2 不同稀釋液配方對精液冷凍保存效果的影響由表3可知，稀釋液配方4、6、7、8解凍后精子的活力明顯高于稀釋液配方1、2、3、5，頂體完整率要明顯高于配方1、2、3、5，均差異顯著（P＜0.05）；配方6中的精子活力及頂體完整率效果好于其他7組，差異顯著（P ＜0.05）。各組間的精子頂體完整率檢驗結(jié)果表明，稀釋液配方4、6、7、8顯著低于稀釋液配方1、2、3、5（P ＜0.05），而配方6要優(yōu)于配方4、7、8，且差異顯著（P ＜0.05）。

表2 在不同稀釋液配方中保存藏獒精子的平均活力（18℃）

表3 8種稀釋液配方中精子活力大于0.3的存活時間 h

表4 不同稀釋液對精液冷凍保存效果 %

3 結(jié) 論

頂體是在形成精子過程中由高爾基復(fù)合物發(fā)育而成的膜性細(xì)胞器,位于核與原生質(zhì)膜之間,像帽子一樣復(fù)蓋著核的前2/3。在電子顯微鏡下可清楚見到頂體由三部分組成，即較厚而致密的頂體層(它在核的頂端隆起并往回折形成頂脊)、鄰近核膜的內(nèi)膜及鄰近原生質(zhì)膜的外膜。精子頂體在受精過程中具有重要作用，它能釋放多種蛋白分解酶，消化卵丘細(xì)胞間的黏合基質(zhì)，使精子通過卵的各個膜層進(jìn)行受精。理論上只有呈前進(jìn)運動且具完整頂體的精子才有受精能力。用精子活力（呈前進(jìn)運動的精子）和精子頂體完整率評定精液品質(zhì)及受精力較理想。實驗結(jié)果表明，用三羥甲基氨基甲烷（Tris）3.075 g、果糖1.275 g、檸檬酸鈉1.7 g、卵黃20 mL、青霉素10 IU、鏈霉素10 IU和甘油3 mL配制的藏獒精液冷凍保存液,滲透壓420 mOsm/L,精子活力和頂體完整率都較高，能滿足藏獒輸精和進(jìn)行超低溫冷凍保存精子的標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 張春華.中國藏獒發(fā)展現(xiàn)狀與存在的問題[J].中國鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)技術(shù)市場, 2004, (12):14-15.

[2] 鄢詢,崔泰保.河曲藏獒保種措施的探討[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2002, 37( 2): 166-169.

S829.903

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-055

2016-07-25；

2016-08-24

種青海省科學(xué)技術(shù)廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（2014-ZJ-738）

薛曉蓉（1963-），女，高級畜牧師，主要從事畜種改良工作，E-mail：1547705009@qq.com