黃勛和，張金楓，陳潔波，李威娜，鐘福生，杜炳旺

（1. 嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514015；2. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088）

貴妃雞與麒麟雞微衛(wèi)星遺傳多樣性研究

黃勛和1，張金楓1，陳潔波1，李威娜1，鐘福生1，杜炳旺2*

（1. 嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514015；2. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088）

以嶺南黃雞為參照，利用微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)貴妃雞和麒麟雞的遺傳多樣性，評(píng)估群體遺傳資源現(xiàn)狀。結(jié)果表明：26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在30個(gè)貴妃雞、40個(gè)麒麟雞和30個(gè)嶺南黃雞個(gè)體中共檢測(cè)到197個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因范圍為3個(gè)（MCW0037、MCW0165、MCW0098）～19個(gè)（LEI0234），平均7.58；總體平均期望雜合度為0.6816，平均觀察雜合度0.5625，平均多態(tài)信息含量0.6327；嶺南黃雞的遺傳多樣性最高，麒麟雞次之，貴妃雞最低；3個(gè)群體均偏離了哈迪-溫伯格平衡；貴妃雞和麒麟雞的群體內(nèi)近交系數(shù)高于嶺南黃雞，表明前者的近親交配事件較頻繁；麒麟雞群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)（均值0.2433）和嶺南黃雞（0.2281）大于貴妃雞（0.0359），表明后者的有效群體較小。在后續(xù)的品種選育工作中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)親本親緣關(guān)系的評(píng)估，提高選育群體的有效數(shù)量，盡量減少近親交配。

微衛(wèi)星；多態(tài)性；貴妃雞；麒麟雞；嶺南黃雞；近交

貴妃雞（Princess Chicken），又稱(chēng)貴婦雞，原產(chǎn)于法國(guó)，主要分布于法國(guó)、英國(guó)、荷蘭等歐洲國(guó)家，是著名的觀賞與肉用珍禽；21世紀(jì)初廣東海洋大學(xué)家禽育種中心率先系統(tǒng)研究了貴妃雞，培育出商用配套系，得到了廣泛的推廣。麒麟雞（Frizzle Chicken）因羽毛向上翻卷而聞名，故又稱(chēng)翻毛雞、卷毛雞；卷羽有利于雞體表的散熱，適合熱帶或中國(guó)南方地區(qū)飼養(yǎng)，是原產(chǎn)于粵西地區(qū)的特色地方品種。貴妃雞與麒麟雞的研究主要集中在生物學(xué)基礎(chǔ)特性[1-3]、品種選育[4-5]、生產(chǎn)與應(yīng)用[6-7]等，在遺傳多樣性方面研究則較少[8-9]。

家禽遺傳多樣性的下降和侵蝕引起了人們廣泛的關(guān)注。在許多品種的選育過(guò)程中，對(duì)父母代種群的選擇往往只考慮外部形態(tài)及性狀的整齊性，未考慮親緣關(guān)系、遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)等遺傳背景。研究表明，近親雜交可能會(huì)引起后代生存能力及生產(chǎn)性能的下降，不利于品種的保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用，從而降低經(jīng)濟(jì)效益。維持種內(nèi)的遺傳多樣性，有助于物種和種群的自身繁殖能力和人工選擇潛能。因此，評(píng)估品種的遺傳多樣性水平有助于品種的保種選育和生產(chǎn)應(yīng)用[10]。

微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記具有共顯性遺傳、遺傳穩(wěn)定、高多態(tài)性、受進(jìn)化選擇壓力小等特點(diǎn)，被廣泛用于群體遺傳多樣性、遺傳分化、基因交流和品種間混合等研究[11-12]。本研究以廣東飼養(yǎng)廣泛的商品雞—嶺南黃雞為參考群體，應(yīng)用微衛(wèi)星位點(diǎn)研究貴妃雞與麒麟雞的遺傳多樣性，評(píng)估品種的遺傳資源現(xiàn)狀，為品種的保種選育與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 30只貴妃雞和40只麒麟雞樣品來(lái)源于廣東海洋大學(xué)家禽育種中心，30只嶺南黃雞（Ⅲ號(hào)配套系）來(lái)源于廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧研究所，肱靜脈取血，95%乙醇-81℃保存?；蚪MDNA采用試劑盒HiPure Tissue DNA Mini Kit（廣州美基生物技術(shù)有限公司）提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇與PCR擴(kuò)增 26對(duì)微衛(wèi)星引物來(lái)自于世界糧農(nóng)組織推薦的位點(diǎn)（表1），由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。正向或反向引物5'端加上熒光標(biāo)記。多重PCR反應(yīng)體系為10 μL，含5 μL Multiplex PCR MasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），引物0.1～0.4 μL（20 μmol/L），DNA模板 50～100 ng。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min，然后30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，58～60℃退火1 min，72℃延伸1 min），最后72℃延伸7 min。取2 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶是否成功擴(kuò)增。

表1 微衛(wèi)星引物信息與退火溫度

組合 序號(hào) 引物名稱(chēng) 引物序列（5'→3'） 退火溫度,℃ 擴(kuò)增片段, bp 23 MCW0078 F： CCACACGGAGAGGAGAAGGTCTⅥ135～148 R： TAGCATATGAGTGTACTGAGCTTC 24 MCW0067 F： GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT 176～182 R： GAGATGTAGTTGCCACATTCCGAC 25 MCW0098 F： GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG 261～265 R： CGATGGTCGTAATTCTCACGT 26 MCW0330 F： TGGACCTCATCAGTCTGACAG 258～292 R： AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC 60

1.3 基因分型 多重PCR產(chǎn)物經(jīng)變性處理后在ABI PRISM 3730自動(dòng)毛細(xì)管分析儀檢測(cè)，由無(wú)錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司完成。LIZ500為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用軟件GeneMarker 2.2.0對(duì)電泳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行等位基因大小判讀，并輔以人工校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 等位基因數(shù)(N)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)由 Cervus 3.0.3執(zhí) 行。F-statistics統(tǒng)計(jì)分析由GENETIX 4.05計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星PCR結(jié)果與基因分型 多重PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均能較均勻地?cái)U(kuò)增出來(lái)，并且清晰可辨，說(shuō)明多重PCR擴(kuò)增體系較為優(yōu)化（圖1A）。毛細(xì)管凝膠電泳熒光電泳檢測(cè)結(jié)果也較為清晰，不同等位基因錯(cuò)落分布，能夠準(zhǔn)確讀取等位基因大?。▓D1B、C）。

圖1 多重圖與基因分型圖

2.2 群體遺傳多樣性 26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在貴妃雞、麒麟雞和嶺南黃雞共100個(gè)個(gè)體的檢出成功率為99.88%，共檢測(cè)到197個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因范圍為3～19個(gè)，平均7.58。位點(diǎn)LEI0234的等位基因最多，為19個(gè)，其次是MCW0183，為17個(gè)，排在第3的是LEI0094和MCW0104，為15個(gè)，而位點(diǎn)MCW0037、MCW0165和MCW0098均只有3個(gè)等位基因?？傮w平均期望雜合度為0.6816，平均觀察雜合度為0.5625，平均多態(tài)信息含量為0.6327。在3種雞品種中，嶺南黃雞的遺傳多樣性最高，麒麟雞次之，貴妃雞最低，即平均等位基因數(shù)量、觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量均按嶺南黃雞、麒麟雞和貴妃雞依次遞減（表2）。在觀察雜合度低于0.5的位點(diǎn)中，貴妃雞有15個(gè)，麒麟雞和嶺南黃雞各有4個(gè)。值得注意的是，貴妃雞有2個(gè)位點(diǎn)（MCW0295和MCW067）雜合度為0。3個(gè)雞群體均偏離了哈迪-溫伯格平衡（P＜0.0001）。

2.3 群體間的遺傳分化 群體間的遺傳距離（Fst）分別為貴妃雞—麒麟雞（0.2411）、貴妃雞—嶺南黃雞（0.2454）和麒麟雞—嶺南黃雞（0.0362）。貴妃雞和麒麟雞的群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）高于嶺南黃雞，但貴妃雞的總近交系數(shù)要低于麒麟雞和嶺南黃雞（表3）。麒麟雞群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)（均值0.2433）和嶺南黃雞（0.2281）要高于貴妃雞（0.0359）。

表2 基于26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的貴妃雞、麒麟雞與嶺南黃雞遺傳多樣性分析

3 討 論

本研究利用26對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)比較分析了貴妃雞、麒麟雞和嶺南黃雞的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，3個(gè)雞種群體的遺傳多樣性均較低，低于五華三黃雞[13]等地方雞。雖然研究樣本數(shù)量差異對(duì)結(jié)果會(huì)有一定的影響，但本研究的3個(gè)品種樣本量均在30份及以上，能夠保證95%的等位基因被檢出，可以較好地反映出檢測(cè)群體的遺傳多樣性水平[14]。

進(jìn)一步分析顯示貴妃雞和麒麟雞的遺傳多樣性低于嶺南黃雞，尤其是貴妃雞，He、Ho和PIC均遠(yuǎn)低于0.5。一般認(rèn)為，PIC大于0.5，說(shuō)明群體遺傳多樣性較高，反之則較低[15]。這可能與它們的選育歷史有關(guān)。貴妃雞最早由民間從國(guó)外零散引進(jìn)飼養(yǎng)，然后廣東海洋大學(xué)家禽育種中心收集后從有限的親代個(gè)體開(kāi)始選育[4]。線粒體D-loop研究也顯示貴妃雞的核苷酸多態(tài)度較低[8]，低于其他地方雞，如黃郎雞的0.01254[16]等。麒麟雞是粵西地區(qū)有名的特色土雞，飼養(yǎng)歷史悠久，種群數(shù)量大。而嶺南黃雞是廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所培育的黃羽肉雞新品種，本研究樣品來(lái)源于慢羽優(yōu)質(zhì)型品種（即Ⅲ號(hào)配套系），含惠陽(yáng)胡須雞和廣西三黃雞的血緣?；蓐?yáng)胡須雞和廣西三黃雞是華南地區(qū)優(yōu)質(zhì)地方雞品種，遺傳多樣性水平較高[17-18]。此外，貴妃雞與麒麟雞和嶺南黃雞的遺傳距離均大于麒麟雞與嶺南黃雞，也從側(cè)面說(shuō)明了它們具有不同的選育歷史。因?yàn)橘F妃雞是外來(lái)引進(jìn)品種，而麒麟雞和嶺南黃雞分布于廣東地區(qū)，可能具有一定的親緣關(guān)系。

表3 F-statistics統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

貴妃雞和麒麟雞的群體近交系數(shù)明顯高于嶺南黃雞，說(shuō)明前者種群內(nèi)近親交配事件較頻繁；同時(shí)群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)低于嶺南黃雞，說(shuō)明貴妃雞和麒麟雞的有效群體較小。因此，在后續(xù)的品種選育工作中應(yīng)加強(qiáng)親本親緣關(guān)系的評(píng)估，提高選育群體的有效群體數(shù)量，同時(shí)盡量減少近親交配。

[1] 吳嬋, 李敬瑞, 李輝, 等. 貴妃雞生長(zhǎng)發(fā)育性狀的測(cè)定與分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 38(16): 96-98.

[2] 陶林, 杜炳旺, 張麗. 卷羽雞毛囊發(fā)育規(guī)律及卷羽候選基因KRT75遺傳特征分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(4): 821-830.

[3] Sharifi A R, Horst P, Simianer H. The effect of frizzle gene and dwarf gene on reproductive performance of broiler breeder dams under high and normal ambient temperatures[J]. Poult Sci, 2010, 89(11): 2356–2369.

[4] 杜炳旺, 曹寧賢, 王效京, 等. 中國(guó)珍禽貴妃雞商用配套系的獨(dú)有特性及發(fā)展前景[A]. 安全優(yōu)質(zhì)的家禽生產(chǎn)[C].廣州: 華南理工大學(xué)出版社, 2011, 11: 287-291.

[5] 李乃賓, 楊芬霞, 杜炳旺, 等. 貴妃雞與麒麟雞雜交后代主要性狀的測(cè)定與分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 43(4): 114-118.

[6] 王勇, 王錫香, 曲全科. 貴妃雞林地放養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2011, 32(8): 111-112.

[7] Magothe T M, Muhuyi W B, Kahi A K. In fl uence of major genes for crested-head, frizzle-feather and naked-neck on body weights and growth patterns of indigenous chickens reared intensively in Kenya[J]. Trop Anim Health Pro, 2010, 42(2): 173-183.

[8] 吳嬋, 李輝, 李敬瑞, 等. 基于線粒體DNA控制區(qū)(mtDNA D-loop)序列分析貴妃雞的遺傳多樣性[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2012, 39(12): 137-139.

[9] 吳嬋, 李輝, 李敬瑞, 等. 基于線粒體細(xì)胞色素b基因全序列分析貴妃雞的遺傳多樣性[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2013, 2: 51-53.

[10] Soller M, Weigend S, Romanov M N, et al. Strategies to assess structural variation in the chicken genome and its associations with biodiversity and biological performance[J]. Poult Sci, 2006, 85(12): 2061-2078.

[11] Mwacharo J M, Nomura K, Hanada H, et al. Reconstructing the origin and dispersal patterns of village chickens across East Africa: insights fromautosomal markers[J]. Mol Ecol, 2013, 22(10): 2683-2697.

[12] Mahammi F Z, Gaouar S B S, Lalo? D, et al. A molecular analysis of the patterns of genetic diversity in local chickens from western Algeria in comparison with commercial lines and wild jungle fowls[J]. J Anim Breed Genet, 2016, 133(1): 59-70.

[13] 黃勛和, 李威娜, 陳珊, 等. 五華三黃雞群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國(guó)家禽, 2016, 38(1): 56-58.

[14] 包文斌, 束婧婷, 許盛海, 等. 樣本量和性比對(duì)微衛(wèi)星分析中群體遺傳多樣性指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)畜牧雜志, 2007, 43(1): 6-9.

[15] Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Anim J Hum Genet, 1980, 32(3): 314.

[16] 黃勛和, 翁茁先, 李威娜, 等. 基于線粒體DNA D–loop序列的黃郎雞遺傳多樣性與品種起源研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 42(1): 75–80.

[17] 竇新紅, 韋鳳英, 黃雄, 等. 廣西三黃雞群體遺傳多樣性研究[J]. 中國(guó)家禽, 2011, 33(15): 20-23.

[18] Yu Y B, Wang J Y, Mekki D M, et al. Evaluation of genetic diversity and genetic distance between twelve Chinese indigenous chicken breeds based on microsatellite markers[J]. Int J Poult Sci, 2006, 5(6): 550-556.

Genetic Diversity of Princess Chicken and Frizzle Chicken Inferred from Microsatellites

HUANG Xun-he1, ZHANG Jin-feng1, CHEN Jie-bo1, LI Wei-na1, ZHONG Fu-sheng1, DU Bing-wang2*
(1. School of Life Sciences, Jiaying University, Guangdong Meizhou 514015, China; 2. College of Agricultural, Guangdong Ocean University, Guangdong Zhanjiang 524088, China)

The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and genetic resources status of Princess chicken and Frizzle chicken, using microsatellite loci and use of Lingnan chicken for inferred samples. A total of 197 alleles was detected from 30 Princess chicken, 40 Frizzle chicken and 30 Lingnan chicken in 26 microsatellite loci. The number of alleles per locus ranged from 3 (MCW0037, MCW0165 and MCW0098) to 19 (LEI0234), with an average of 7.58. The mean expected heterozygosity, observed heterozygosity and polymorphic information content were 0.6816, 0.5625 and 0.6327, respectively. Lingnan chicken had the highest levels of genetic diversity, Frizzle chicken had the second one and Princess chicken had the lowest one. All these three chicken populations were deviated from Hardy-Weinberg equilibrium. The inbreeding coefficient within population of Princess chicken and Frizzle chicken was higher than that in Lingnan chicken, suggesting that high inbreeding events in former breeds. The genetic divergence coefficient within population of Frizzle chicken (0.2433, mean value) and Lingnan chicken (0.2281, mean value) was higher than that in Princess chicken (0.0359, mean value), indicating that small e ff ective population size in latter breed. Our results suggested that evaluation of genetic relationship for breeding need to be reinforced in the future, as well as to increase the effective parental population and to decrease inbreeding as possible.

Microsatellite; Polymorphism; Princess chicken; Frizzle chicken; Lingnan chicken; Inbreeding

S831.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-030

2016-05-04；

2016-06-15

種廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030307018）；嘉應(yīng)學(xué)院“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目（CQX019）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A020208020、2016A030303068)；國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)-特種動(dòng)物子平臺(tái)建設(shè)（201520）；嘉應(yīng)學(xué)院重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015KJM03）

黃勛和（1982-），男，廣東河源人，博士，講師，主要從事中國(guó)家雞遺傳多樣性與進(jìn)化研究，E-mail：hxh826@ jyu.edu.cn

* 通訊作者：杜炳旺，教授，主要從事家禽育種與生產(chǎn)研究，E-mail：dudu903@163.com