毛哲哲胡彥峰 郭佳佳 王慧玲 馮 強(qiáng) 常 健 陳奎利 程 忠

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

燈盞花素對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究

毛哲哲△胡彥峰 郭佳佳 王慧玲 馮 強(qiáng) 常 健 陳奎利 程 忠

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

目的 研究燈盞花素（Bre）對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法 通過(guò)夾閉左肺門(mén)45 min的方法建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，術(shù)前30 min分別給予Bre（12.5、25、50 mg/kg）進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)假手術(shù)組和模型組。再灌注2 h后測(cè)定肺組織濕/干重比（W/D），比色法測(cè)定肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和血清中總抗氧化能力（T-AOC）水平、髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性、丙二醛（MDA）含量；蘇木精-尹紅（H&E）染色法觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；TUNEL法觀察肺組織細(xì)胞凋亡狀況；通過(guò)透射電子顯微鏡觀察肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與模型組比較，Bre 25、50 mg/kg組大鼠肺組織W/D降低，肺組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和血清中T-AOC水平均提高，血清中MPO活性和MDA含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05或P＜0.01）。H&E染色后光鏡下可見(jiàn)模型組肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、上皮細(xì)胞變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，TUNEL染色后光鏡下可見(jiàn)模型組肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，透射電鏡下可見(jiàn)肺毛細(xì)血管通透性增加、分界不清，肺泡內(nèi)有血漿成分、間隔增厚等病變；經(jīng)Bre干預(yù)能夠明顯改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織病變和細(xì)胞凋亡狀況，顯著降低細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）（P＜0.01）。結(jié)論 Bre可能通過(guò)降低氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡、改善肺組織病變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變而對(duì)肺缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用。

肺缺血再灌注 燈盞花素 氧化應(yīng)激 凋亡 超微結(jié)構(gòu)

燈盞花是菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，又名燈盞細(xì)辛，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，首載于《滇南本草》，性寒、微苦、甘溫辛，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消炎止痛之功。燈盞花素（Bre）是燈盞花的主要活性成分，現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Bre屬于黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學(xué)活性［1-4］。既往研究發(fā)現(xiàn)Bre能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡而對(duì)腦組織、心肌、腎臟、肝臟等組織器官缺血再灌注損傷均表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用［4-7］，但Bre是否對(duì)肺缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，近年來(lái)病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡在肺缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［8-10］，因此本研究通過(guò)制備肺缺血再灌注大鼠模型并給予Bre進(jìn)行干預(yù)治療，以抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，研究Bre對(duì)肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100只實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD大鼠（雄性，鼠齡6～7周，體質(zhì)量200～240 g），購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素注射液購(gòu)自石藥銀湖制藥有限公司 （規(guī)格20 mg：5 mL，批號(hào)1011411024）；HE、TUNEL染色試劑盒和 T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT、MPO、MDA試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 分組與造模 100只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、燈盞花素（12.5、25、50 mg/kg）組，各20只（n=20）；除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照文獻(xiàn)報(bào)道方法建立大鼠肺缺血再灌注模型［6］。腹腔注射烏拉坦實(shí)施麻醉、氣管插管并連接動(dòng)物呼吸機(jī)（設(shè)置參數(shù)70次/min，潮氣量20 mL/kg，呼吸比1∶1），于左胸第4肋和第5肋間開(kāi)胸，剝離左肺門(mén)并用無(wú)創(chuàng)血管夾閉45 min后松開(kāi)恢復(fù)血流灌注，逐層縫合；假手術(shù)組只行手術(shù)通路而不夾閉血管。Bre各質(zhì)量濃度組分別于術(shù)前30 min腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組同步給予等體積0.9%氯化鈉注射液；再灌注2 h后，取標(biāo)本進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）測(cè)定肺組織濕/干比重（W/ D）：每組隨機(jī)取6只大鼠，經(jīng)麻醉后取肺組織稱(chēng)重為濕重（W），置60℃烘箱24 h后稱(chēng)重為干重（D），然后計(jì)算肺組織濕/干比重（W/D）。2）氧化應(yīng)激監(jiān)測(cè)指標(biāo)：每組隨機(jī)取8只大鼠麻醉后取肺組織，用0.9%氯化鈉注射液制備1%肺組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取上清液，按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組大鼠肺組織中抗氧化酶（SOD、GSHPx、CA）T活性。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心 （1500 r/min，10 min）取血清，采用比色法通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性和MDA含量。3）肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞凋亡狀況：每組取剩余的6只大鼠麻醉后取肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋和切片處理后，行常規(guī)H&E染色后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并照相保存，行TUNEL染色后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡狀況并照相保存。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）的計(jì)算：計(jì)數(shù)每張染色切片中細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù) （細(xì)胞核黃褐色為陽(yáng)性著色），然后計(jì)算AI：AI（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/肺總細(xì)胞數(shù)）×100%。4）肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：取肺組織并迅速剪切并修成約1 mm3小塊，經(jīng)2.5%戊二醛預(yù)固定1 h、PBS漂洗、1%鋨酸后固定1 h、丙酮梯度脫水、包埋和超薄切片處理后，行雙鉛染色，然后通過(guò)透射電鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響

見(jiàn)表1。結(jié)果示，肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D與假手術(shù)組比較升高（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預(yù)處理則能夠降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織W/D值（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響s）

表1 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01。下同。

組別 n假手術(shù)組 6模型組 6 Bre 12.5 mg/kg組 6 W/D（%）5.0±0.4 6.7±0.8△△6.4±0.9 Bre 25 mg/kg組 6 5.8±0.5*Bre 50 mg/kg組 6 5.3±0.5**

2.2 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織中抗氧化酶活性的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果示，肺缺血再灌注大鼠肺組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性與假手術(shù)組比較降低（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預(yù)處理則能提高肺缺血再灌注大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織中氧化酶活性的影響（U/mg，±s）

表2 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織中氧化酶活性的影響（U/mg，±s）

2.3 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響 見(jiàn)表3。結(jié)果示，肺缺血再灌注模型大鼠血清中T-AOC水平與假手術(shù)組比較降低（P＜0.01），而MPO活性、MDA含量升高（P＜0.01）。經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預(yù)處理則能提高T-AOC水平并降低MPO活性和MDA含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響（±s）

表3 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠血清中T-AOC水平、MPO活性、MDA含量的影響（±s）

組別 n假手術(shù)組 8模型組 8 Bre 12.5 mg/kg組 8 Bre 25 mg/kg組 8 Bre 50 mg/kg組 8 T-AOC（U/mL） MPO（IU/L） MDA（nmol/L）23.9±2.8 3.5±0.7 2.8±0.3 15.1±2.2△△9.4±1.8△△8.7±1.2△△15.9±2.5 7.2±2.0 7.9±0.9 18.7±3.0*5.6±1.4*5.8±0.7**21.5±3.3**4.5±1.2**4.2±0.4**

2.4 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖1。結(jié)果示，各組大鼠肺組織經(jīng)H&E染色后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察：假手術(shù)組大鼠肺組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)異常；模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、液體滲出，細(xì)胞變性和壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；經(jīng)不同劑量Bre預(yù)處理則能夠不同程度改善肺缺血再灌注大鼠肺組織病變，該作用呈一定依賴(lài)性。

圖1 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，400倍）

2.5 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況的影響見(jiàn)圖2、表4。結(jié)果示，各組大鼠肺組織經(jīng)TUNEL染色后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多；經(jīng)不同劑量Bre預(yù)處理則能夠不同程度減少肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量，該作用具有一定的劑量依賴(lài)性。凋亡指數(shù)（AI）結(jié)果如表4所示，模型組大鼠肺組織細(xì)胞AI較假手術(shù)組增高（P＜0.01），經(jīng)Bre（25、50 mg/kg）預(yù)處理則能降低肺缺血再灌注大鼠AI值（P＜0.01）。

圖2 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況的影響（TUNEL，400倍）

表4 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率（AI）的影響（%，±s）

表4 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率（AI）的影響（%，±s）

組別 n假手術(shù)組 6模型組 6 Bre 12.5 mg/kg組 6 AI 3.6±0.9 34.1±4.8△△27.8±5.4 Bre 25 mg/kg組 6 21.6±3.1**Bre 50 mg/kg組 6 15.3±2.2**

2.6 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖3。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組大鼠細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組大鼠肺組織毛細(xì)血管通透性增加、分界不清，肺泡內(nèi)有血漿成分、間隔增厚，肺細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死等病理性超微結(jié)構(gòu)改變。較模型組，經(jīng)不同劑量Bre預(yù)處理則能夠不同程度改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變，該作用具有一定的劑量依賴(lài)性。

圖3 Bre對(duì)肺缺血再灌注大鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響（TEM）

3 討 論

肺部手術(shù)過(guò)程中往往需要阻斷血流以減少出血，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥的存在嚴(yán)重影響患者治療效果。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展具有非常復(fù)雜的病理機(jī)制，其中氧化應(yīng)激以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用［8-10］，這為能夠改善肺缺血再灌注損傷新型藥物的研發(fā)提供了新的切入點(diǎn)。

Bre是一類(lèi)具有多種生物學(xué)活性的黃酮類(lèi)化合物［1-4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)夾閉左肺門(mén)45 min后恢復(fù)血流的方法建立肺缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行研究，檢測(cè)肺組織W/D發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預(yù)處理能夠顯著緩解肺缺血再灌注損傷大鼠肺水腫，經(jīng)H&E染色后觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預(yù)處理能夠改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，經(jīng)TUNEL染色后觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預(yù)處理能夠顯著降低肺組織AI、有效抑制肺細(xì)胞凋亡，經(jīng)TEM觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre預(yù)處理能夠有效改善肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細(xì)胞超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變，提示Bre對(duì)肺缺血再灌注損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用。

常態(tài)下體內(nèi)氧自由基（ROS）的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，其中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）對(duì)ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用［11-13］；而當(dāng)再灌注后隨著氧的大量涌入，ROS大量生成和過(guò)剩而攻擊細(xì)胞膜造成臟器的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，因此脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映氧化應(yīng)激損傷程度［14］；而總抗氧化能力（T-AOC）水平也能夠反應(yīng)機(jī)體整體抗氧化能力［15］。髓過(guò)氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞特有的酶，其活性能夠反映中性粒細(xì)胞激活和浸潤(rùn)，也能間接反映組織氧化應(yīng)激損傷程度［16］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)：經(jīng)Bre預(yù)處理能夠顯著改善抗氧化酶 （SOD、GSH-Px、CAT）活性、提高血清中T-AOC水平、降低MPO活性和MDA含量，并通過(guò)下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)；提示Bre對(duì)缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，燈盞花素對(duì)肺缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用；其作用機(jī)制可能與燈盞花素能夠有效改善抗氧化酶活性、提高T-AOC水平、降低MPO活性而降低氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，減輕肺水腫，改善肺組織病變和肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變有關(guān)。

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R285.5

A

1004-745X（2017）02-0255-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.022

2016-11-09）

△通信作者（電子郵箱：maozhezhe0614@163.com）