王欣玲羅 霞孫建琴鄒 艷陳德森

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

·研究報(bào)告·

青藤堿對(duì)肝細(xì)胞癌模型大鼠肝移植術(shù)后免疫應(yīng)答的影響*

王欣玲1羅 霞1孫建琴1鄒 艷1陳德森2△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

目的 建立大鼠肝細(xì)胞癌（HCC）模型，觀察青藤堿對(duì)肝細(xì)胞癌大鼠肝移植術(shù)后免疫應(yīng)答的影響。方法將60只雄性Lewis大鼠用二乙基亞硝胺灌胃14周的方法建立大鼠肝細(xì)胞癌模型，成模后將用DA大鼠作為供體進(jìn)行肝臟移植，術(shù)后隨機(jī)分為模型組、青藤堿組。青藤堿組用青藤堿［2.0 mg/（kg·d）］灌胃，模型組灌等體積0.9%氯化鈉注射液。采用ELISA法檢測(cè)第1、2、3、4周肝臟組織中白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）及趨化因子-10（IP-10）；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)靜脈血T細(xì)胞（Treg）、CD4+T、CD8+T等占T淋巴細(xì)胞的百分比。結(jié)果 青藤堿組在第3周和第4周時(shí)，肝臟組織中IL-2、IL-6，靜脈血Treg%、CD4+T%明顯降低，第4周時(shí)TNF-α、TGF-β1和IP-10明顯降低，與模型組比較（P＜ 0.05），且以上各指標(biāo)在4周時(shí)的檢測(cè)值與同組1、2、3周時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。結(jié)論 青藤堿可抑制肝細(xì)胞癌大鼠肝移植術(shù)后細(xì)胞免疫。

大鼠 青藤堿 肝細(xì)胞癌 肝臟移植 細(xì)胞免疫 免疫應(yīng)答

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的75%～80%［1］。WHO統(tǒng)計(jì)顯示，這各病理類型的肝癌患者死亡率高、預(yù)后差，占所有惡性腫瘤死亡率的第2位，且一半以上的肝癌發(fā)生在我國［2］。由于肝細(xì)胞癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且傳統(tǒng)抗癌藥治療療效不佳，而肝臟移植是中晚期肝細(xì)胞癌5年生存率最高的治療方法，但器官移植后免疫反應(yīng)常造成器官排斥，如何降低排斥反應(yīng)、提高移植成功率、提高5年生存率成為當(dāng)前治療至關(guān)重要的研究?jī)?nèi)容。中醫(yī)中藥在抗癌方面往往發(fā)揮著重要作用，如青藤堿，目前體外實(shí)驗(yàn)均顯示其具有抗腫瘤的藥理活性［3］。青藤堿是中草藥防己科植物青風(fēng)藤的根莖提取而成的生物堿單體，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，國內(nèi)已有鹽酸青藤堿注射液、鹽酸青藤堿片等制劑，用于治療急性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白血病、前列腺癌、肺癌、肝細(xì)胞癌及宮頸癌等，均有一定的抗腫瘤作用［4］。筆者在本移植實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)觀察了青藤堿對(duì)肝細(xì)胞癌肝移植術(shù)后大鼠細(xì)胞免疫功能的影響，為臨床肝臟移植提供可靠的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Lewis大鼠 （受體）和雄性DA大鼠（供體）各60只，9～10周齡，體質(zhì)量180～200 g，十堰市太和醫(yī)院科研中心從上海購進(jìn) ［許可證SYXK（鄂）2014-0031］。

1.2 藥物與試劑 鹽酸青藤堿腸溶片（煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司，批號(hào)H37023717，規(guī)格20 mg）；二乙基亞硝胺（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)H20160211）；戊巴比妥鈉 （上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)H0160527）；大鼠白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）ELISA試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)0160524、0160528、0160526）。大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、趨化因子-10（IP-10）ELISA試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)XF160420、XF160422、XF160426）。

1.3 造模方法 將60只受體Lewis大鼠，用0.2%二乙基亞硝胺，按10.0 mg/（kg·d）的劑量灌胃，每周5次，連續(xù)灌胃14周的方法誘導(dǎo)與人類相似的肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型［5］。灌胃建模方法劑量較準(zhǔn)確、動(dòng)物死亡率低，可穩(wěn)定建立與人肝細(xì)胞癌類似的大鼠肝細(xì)胞癌模型，其誘癌率達(dá)100%，在本建模過程中，死亡Lewis大鼠6只，存活率90%。

1.4 移植方法與分組 成模后，選擇相同數(shù)量的雄性DA大鼠（供體），將供體肝臟移植于存活的54只Lewis大鼠。手術(shù)方法與步驟：術(shù)前供體、受體大鼠均應(yīng)禁食10 h以上，不禁水。在肝臟移植手術(shù)前，肌肉注射0.04 mg阿托品注射液，用3%戊巴比妥鈉尾靜脈注射麻醉大鼠。本手術(shù)供、受體手術(shù)同時(shí)進(jìn)行，動(dòng)物麻醉后固定，剃去上腹部皮膚上的鼠毛，消毒，開腹，取供體大鼠肝臟，用4℃臺(tái)氏液中沖洗。同時(shí)切除受體Lewis大鼠肝臟，采用改良雙袖套法，將供肝移植于受體動(dòng)物［6］。術(shù)后將受體大鼠隨機(jī)分為模型組和青藤堿組。移植術(shù)后統(tǒng)計(jì)兩組大鼠第1、2、3、4周存活只數(shù)。

1.5 給藥方法 用碾缽將鹽酸青藤堿腸溶片碾碎，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成10%的混懸液，術(shù)后青藤堿組按2.0 mg/（kg·d）的劑量灌胃，模型組灌等量0.9%氯化鈉注射液，兩組均灌胃治療4周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 在第1、2、3周時(shí)，模型組和青藤堿組各取大鼠8只，第4周取所剩大鼠，尾靜脈取血0.5 mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T、Treg和CD4+T細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算以上指標(biāo)所占T淋巴細(xì)胞比例 （用%表示）［7］。然后斷頭處死，迅速取肝，采用ELISA法檢測(cè)肝IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IP-10、TGF-β1［8］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s）表示，兩組間第1、2、3、4周比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本Lsd-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠存活情況 經(jīng)統(tǒng)計(jì)，模型組第1、2、3、4周分別存活35、24、15、6只，青藤堿組第1、2、3、4周分別存活46、30、20、11只。青藤堿大鼠存活數(shù)量明顯高于模型組。

2.2 青藤堿對(duì)Treg、CD4+T、CD8+T比值的影響 見表1。第1、2、3、4周對(duì)兩組血液樣中Treg、CD4+T、CD8+T進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果模型組以上指標(biāo)保持較高水平，且4周內(nèi)無明顯升高或降低；青藤堿組在治療3、4周時(shí)Treg、CD4+T明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且4周時(shí)檢測(cè)值與同組1、2、3周時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 青藤堿對(duì)IL-2、IL-6和IL-10的影響 見表2。第1、2、3、4周時(shí)兩組標(biāo)本IL-2、IL-6和IL-10檢測(cè)結(jié)果：模型組均無明顯升高或降低；青藤堿組3、4周IL-2、IL-6明顯降低，與模型組比較（P＜0.05），4周時(shí)IL-2、IL-6檢測(cè)值與同組1、2、3周時(shí)比較（P＜0.05）。

2.4 青藤堿對(duì)TGF-β1、TNF-a和IP-10的影響 見表3。模型組在第1、2、3、4周時(shí)TGF-β1、TNF-α和IP-10保持較高水平，且4周內(nèi)無明顯升高或降低；青藤堿組治療4周時(shí)TGF-β1、TNF-α和IP-10均明顯降低，與模型組比較（P＜0.05），且4周時(shí)檢測(cè)值與同組1、2、3周時(shí)比較（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠肝組織IL-2、IL-6、IL-10比較（pg/mL，±s）

表2 兩組大鼠肝組織IL-2、IL-6、IL-10比較（pg/mL，±s）

組別時(shí)間 IL-10模型組 1周 11.96±1.72（n＝8） 2周 12.41±2.04 3周 11.26±1.96 10.84±1.92 7.91±0.53青藤堿組 1周 10.45±1.48 8.90±1.12 10.72±1.76（n＝8） 2周 9.03±1.52 7.14±0.83 9.87±1.22 3周 5.75±0.82*☆△4.02±0.57*☆△9.02±1.27 4周 1.55±0.43*☆△◇1.42±0.28*☆△◇9.71±0.94 IL-2 IL-6 9.95±1.72 7.69±0.87 10.05±1.10 8.89±1.09 11.27±0.97 8.67±0.97 4周 12.42±1.03

表3 兩組大鼠TGF-β1、TNF-α和IP-10比較（pg/mL，±s）

表3 兩組大鼠TGF-β1、TNF-α和IP-10比較（pg/mL，±s）

組別 時(shí)間 IP-10模型組 1周 143.17±14.65（n＝8） 2周 135.25±12.38 3周 129.47±13.80 91.49±9.97 3.34±0.09青藤堿組 1周 89.07±10.52 2.79±0.14 135.81±17.32（n＝8） 2周 90.51±9.27 2.96±0.24 129.27±15.02 3周 86.71±9.72 2.09±0.15 125.81±17.32 4周 62.44±9.05*☆△◇1.43±0.10*☆△◇92.27±14.49*☆△◇TGF-β1 TNF-α 91.07±10.18 3.27±0.16 93.82±12.57 3.01±0.12 90.65±10.48 2.97±0.17 4周 134.71±14.76

3 討 論

病毒性肝炎、肝硬化是肝細(xì)胞癌的主要致病因素，肝細(xì)胞癌的演變過程大致如下：肝細(xì)胞炎癥壞死-纖維化-硬化-再生結(jié)節(jié)-不典型增生結(jié)節(jié)-癌變［9］。目前對(duì)于肝細(xì)胞癌的研究很大程度上依賴肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)以Lewis大鼠為受體，采用二乙基亞硝胺灌胃的方法建肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型，成模后再用DA大鼠為供體進(jìn)行肝移植，用以研究中藥提取物青藤堿對(duì)肝細(xì)胞癌移植術(shù)后免疫應(yīng)答的影響。

研究表明，因子IL-2、IL-6和IL-10等具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，是機(jī)體調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，它們正常情況下保持一定的水平，刺激淋巴細(xì)胞，并使之活化，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在炎癥、腫瘤活動(dòng)期，因子IL-2、IL-6和IL-10受炎癥因子、腫瘤因子調(diào)控而大量合成，特別是因子IL-2，可刺激淋巴細(xì)胞向炎癥、腫瘤部位集聚，此時(shí)大量Treg細(xì)胞開始加劇分化，活化的T reg又會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo) T、B細(xì)胞增殖，IL-2、IL-6和IL-10激發(fā)的免疫效應(yīng)器細(xì)胞又會(huì)產(chǎn)生如TGF-β1、TNF-α和IP-10等各種細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答［10］。免疫應(yīng)答有利于機(jī)體消除疾病如炎癥、腫瘤的病因，但免疫排斥反應(yīng)也會(huì)造成不利于病變組織的修復(fù)，特別是腫瘤器官移植，免疫排斥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致移植體失活等嚴(yán)重后果，故在腫瘤器官移植時(shí)需要抑制這種過度的免疫排斥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤器官移植時(shí)均會(huì)伴有嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，此時(shí)IL-2、IL-6和IL-10等因子高表達(dá)。故在器官移植后，通過不同方法抑制IL-2、IL-6和IL-10等基因表達(dá)可阻斷抗原遞呈作用而減輕免疫排斥反應(yīng)［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別在使用青藤堿治療1、2、3、4周時(shí)檢測(cè)了IL-2、IL-6和IL-10含量，發(fā)現(xiàn)青藤堿組在第3周和第4周時(shí)，肝臟組織中IL-2、IL-6明顯降低，靜脈血中Treg%、CD4+T%明顯降低，第4周時(shí)TNF-α、TGF-β1和IP-10明顯降低，且這些指標(biāo)在4周時(shí)的檢測(cè)值均低于1、2、3周，這提示青藤堿對(duì)肝細(xì)胞癌移植術(shù)后免疫應(yīng)答（細(xì)胞免疫）有明顯的抑制作用。對(duì)于青藤堿在器官移植方面的免疫抑制作用，多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為青藤堿可能主要通過抑制受體大鼠CD4+T細(xì)胞增殖通道，下調(diào)TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮免疫抑制作用［12］。研究表明，T細(xì)胞的活化與鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白磷酸酶活性密切相關(guān)［13］。在本研究中，青藤堿組在治療第3周和第4周時(shí)，肝臟組織中IL-2、IL-6明顯降低，這一結(jié)果是否與青藤堿通過抑制蛋白磷酸酶活性，抑制Treg細(xì)胞增殖，進(jìn)而達(dá)到抑制IL-2、IL-6等因子表達(dá)來發(fā)揮免疫抑制作用還需要進(jìn)一步研究。另有研究表明，CD4+T可識(shí)別由抗原細(xì)胞遞呈的移植抗原，啟動(dòng)移植器官的免疫應(yīng)答，CD4+T能通過增加IL-2、TNF-α等造成用移植器官免疫損傷［14］。在IL-2、IL-6等因子中，IL-2可激活免疫效應(yīng)器細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、TGF-β1等各種繼發(fā)的細(xì)胞因子，這些因子又會(huì)誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，并刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)而加劇移植器官損傷。且初始CD4+T細(xì)胞在IL-6的誘導(dǎo)下分化為Th17細(xì)胞，在TGF-β1誘導(dǎo)下分化為Treg細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)；并在TGF-β1和IL-6的共同誘導(dǎo)下，分化為Th17，參與炎癥反應(yīng)和自身免疫調(diào)控［15-16］。青藤堿可能在這一過程中阻斷IL-6的產(chǎn)生，從而終止Th17細(xì)胞的分化［17-18］。另外，高表達(dá)的IP-l0可誘導(dǎo)大量效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞集聚至移植的肝臟肝細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)大而加劇肝細(xì)胞損傷［19］。在本實(shí)驗(yàn)中，第4周時(shí)TNF-α、TGF-β1和IP-10明顯降低，提示青藤堿也參與了這類因子的調(diào)控，通過下調(diào)TNF-α、TGF-β1和IP-10，調(diào)控IL-2、IL-6等細(xì)胞因子，抑制Treg細(xì)胞增殖，降低CD4+T細(xì)胞分化來達(dá)到抑制細(xì)胞免疫的目的。

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Effect of Sinomenine on the Immune Response in the Rat Model of Hepatocellular Carcinoma after LiverTransplantation

WANG Xinglin，LUO Xia，SUN Jianqin，et al. Taihe Hospital，Hubei University of Medical，Hubei，Shiyan 442000，China.

Objective：To establish the rat model with hepatocellular carcinoma（HCC），and to observe the effect of sinomenine on immune response in rats after liver transplantation for hepatocellular carcinoma.Methods：60 male Lewis rats were made into the rat model with hepatocellular carcinoma with two diethylnitrosamine gastric irrigation method for 14 weeks.After modeling，DA rats after the operation of liver transplantation were randomly divided into the model group and sinomenine group.Sinomenine group received sinomenine gavage［2.0 mg/（kg· d）］，while the model group were given normal saline.ELISA was used to detect interleukin-2（IL-2），IL-6，IL-10，tumor necrosis factor（TNF-α），transforming growth factor beta 1（TGF-beta 1）and chemokine IP-10 in the liver tissue in 1st，2nd，3rd，and 4thweek；flow cytometry was used to detect the percentage of T blood cells（Treg），CD4+T，CD8+T in T lymphocytes.Results：In third week and the fourth week，IL-2，IL-6，Treg%and CD4+T%in venous blood of liver tissue decreased significantly in sinomenine group.In the fourth week，TNF-a，TGF-β1 and IP-10 decreased significantly，compared with the model group（P＜0.05）.And there was significant difference in the detection values of indicators above in 4th weeks in the same group，compared with those in 1st，2nd and 3rd week（P＜0.05）.Conclusion：Sinomenine can inhibit cellular immunity in rats with hepatocellular carcinoma after liver transplantation.

Rat；Sinomenine；Hepatocellular carcinoma；Liver transplantation；Cellular immunity；Immune response

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0222-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.011

2016-10-16）

湖北省教育指導(dǎo)項(xiàng)目（B2016125）

△通信作者（電子郵箱：qingqxjqxj@163.com）