何順偉，李曉燕，趙瑞雪，彭 源，魏曉星，

體液游離寄生蟲DNA在寄生蟲病診斷中的研究進展

何順偉1，李曉燕2，趙瑞雪2，彭 源3，魏曉星1，3

目前在多種寄生蟲感染患者的血清、血漿、尿液、唾液等體液中檢測到相應的游離寄生蟲DNA分子(Cell-Free Parasite DNA, CFPD)，由于其高度的特異性和靈敏性，在寄生蟲病無創(chuàng)診斷和連續(xù)監(jiān)測等方面展示出較強優(yōu)勢。本文即對近年來國內外學者對寄生蟲感染者體液中CFPD的研究現狀作一綜述，以期為今后寄生蟲病診斷的發(fā)展方向提供新思路，并對當前存在的相關問題進行探討。

體液；寄生蟲；游離DNA；診斷；研究進展

寄生蟲病在人類傳染病中占據重要位置，呈世界性流行，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，嚴重危害公眾健康，阻礙社會經濟發(fā)展。及時有效的診斷是寄生蟲病防治的首要環(huán)節(jié)。傳統的方式主要為使用血液、糞便等樣品進行病原學或血清學診斷，盡管它們已經使用了相當長的時期，但在實際應用中仍存在一些不足。例如，病原學診斷易導致漏診或誤診，免疫學診斷易發(fā)生交叉反應且不能區(qū)分現癥感染或既往感染。隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子診斷獨樹一幟，其靈敏性和特異性比前兩者都有所提高，尤其以目標DNA序列為檢測對象的核酸擴增方法更加簡便精確，在寄生蟲病檢測方面展示出廣闊的應用前景。

目前，眾多研究者通過分子診斷技術在瘧疾[1]、利什曼原蟲[2]、錐形蟲[3]、班氏絲蟲[4]和血吸蟲[5]等多種寄生蟲感染患者不同體液中檢測到相應的特異的CFPD，并且發(fā)現其在寄生蟲病診斷中顯示出良好的應用潛能。本文對近年來CFPD在不同寄生蟲病的研究進展做一回顧，以期為寄生蟲病診斷的發(fā)展方向提供思路，并對當前存在的有關問題進行探討。

1 CFPD概述

體液游離DNA (cell-free DNA, cfDNA)為存在于血漿、血清、尿液和唾液等體液中的細胞外游離狀態(tài)的DNA分子。對cfDNA研究的歷史起源于1948年，Mandel和Metais在一篇法國雜志上首次報道發(fā)現在人體血漿中檢測到cfDNA[6]。不幸的是，可能當時由于對cfDNA缺乏清楚的認識，他們的工作并未得到學界重視。而在隨后的30年里，有關cfDNA的報道較少。直到1994年，Sorenson等發(fā)現胰腺癌患者血漿DNA分子存在K-RAS基因突變[7]，學界才重新認識到cfDNA的重要性。隨后有關cfDNA的研究得到迅速展開，并取得眾多進展。盡管關于cfDNA的來源還不清楚，但它作為一種有效的生物標志物對癌癥、產前篩查、損傷、感染等方面的早期診斷具有重要價值，已成為國內外學者研究的熱點。

關于CFPD的來源也是尚不明確，可能是蟲體或蟲卵的細胞或碎片在增生、成熟、脫落、腐爛、崩解等過程中主動分泌或被動釋放出內部的DNA分子進入宿主體液循環(huán)中產生的[3,8]。同cfDNA具有的診斷潛能一樣，CFPD也已被證實可通過傳統PCR、巢氏PCR、實時定量PCR、多重PCR、數字PCR和LAMP(環(huán)介導等溫擴增法)等核酸擴增技術檢測出來，作為寄生蟲病的診斷工具。眾多研究表明[9-12]，CFPD在寄生蟲病檢測中具有高度的靈敏性和特異性，適用于寄生蟲病的明確診斷。并且，使用尿液、唾液等體液作為CFPD的檢測標本，提供了一種非侵入性、無痛、簡便、經濟的樣本采集方式，在需要多個或多次樣本采集時更易于廣大患者接受，有利于提高他們的依從性。因此，對CFPD的研究已成為寄生蟲病診斷研究的新方向，具有重要的實際意義。

2 CFPD在寄生蟲病檢測中的研究

近年來，不同類型CFPD的發(fā)現屢見報道，有些已在相應寄生蟲病的檢測中得到了快速發(fā)展，表1列出了部分學者關于CFPD的研究內容。

表1 近年來CFPD在寄生蟲病檢測中的一些研究
Tab.1 Some researches about CFPD of parasitic disease detection in recent years

分類category種名/基因型specificname/genetype標本specimen檢測方法detectionmethod擴增基因(片段大小)amplificationgenes(fragmentsize)參考文獻references瘧原蟲PlasmodiumP.falciparum血漿巢式PCRssrRNA(205bp)[1]尿液、唾液巢式PCRMSP2[13]巢式PCR,qPCR18SrRNA(205bp)[9]P.vivaxandPlas-modiumfalciparum尿液、唾液巢式PCRssrRNA(P.vivax419bp(P.falciparum452bp)[10]巢式PCR/LAMP18SrRNA[15]弓形蟲ToxoplasmaToxoplasmagondii羊水傳統PCRB1(115bp)[16]傳統PCRB1(120bp,180bp)[17]qPCRB1[18]尿液、腦脊液傳統PCRB1(97bp)[20]眼房水巢式PCRB1、P30、18SrDNA[21]利什曼原蟲LeishmaniaL.viannia尿液傳統PCR微環(huán)kDNA(90bp)minicirclekDNA(90bp)[23]L.infantum尿液傳統PCR微環(huán)kDNA(145bp)[2]巢式PCRssrRNAkDNA(100bp)[22]傳統PCR微環(huán)kDNA(145bp)[24]錐 蟲TrypanosomeT.brucei唾液、尿液(猴模型)傳統PCR/LAMP糖蛋白基因(PCR308bp,LAMP195bp)[26]T.cruzi血清傳統PCR195bp重復序列[3]表1(續(xù))分類category種名/基因型specificname/genetype標本specimen檢測方法detectionmethod擴增基因(片段大小)amplificationgenes(fragmentsize)參考文獻references尿液(豚鼠模型)傳統PCRkDNA(330bp),核DNA(188bp)[25]溶組織內阿米巴Entamoebahisto-lyticaE.histolytica尿液巢式多重PCR16srRNA類似基因(439bp)[27]唾液巢式多重PCR16srRNA類似基因(439bp)[28]唾液、尿液qPCR小亞基rRNA基因(134bp)[29]班氏絲蟲WuchereriabancroftiW.bancrofti尿液(白天)傳統PCRSspI(188bp)[4]血清、尿液半巢式PCRpWb(400bp)[30]痰液傳統PCRWb19(254bp)[31]SspI(188bp)[32]血吸蟲SchistosomeS.mansoni尿液傳統PCR121bp高度重復序列(110bp)[33,11,34]28SrDNA(350bp)[35]

2.1 原蟲

2.1.1 瘧原蟲 在早期研究中，Gal等[1]通過巢式PCR在人類血漿中首次擴增出惡性瘧原蟲核糖體小亞基rRNA(ssrRNA)基因，開創(chuàng)了瘧疾研究的新方向。后來，Mharakurwa等[13]證實了在患者唾液和尿液中也可以檢測到惡性瘧原蟲DNA，并闡明其具有瘧原蟲基因型分型的潛能。該項研究進一步強調，通過優(yōu)化DNA提純技術和擴增結果，可以不需要采集血液樣品來實現大規(guī)模瘧疾篩查和流行病學調查。Najafabadi等[14]以血液樣品作為參考標準，證實使用巢式PCR檢測唾液瘧原蟲DNA的靈敏度和特異度要比尿液高，其中唾液中的靈敏度和特異度同為97%，在尿液中的靈敏度和特異度分別為91%和70%。其他的研究也同樣表明，唾液瘧原蟲DNA的含量與蟲體負荷的相關性比尿液更加顯著[9-10]。因此，基于唾液瘧原蟲DNA取樣的簡便性和良好的PCR檢測效果，將它用于瘧疾的診斷將更有助于該病的縱向監(jiān)督和臨床應用，但仍需要更深入的研究來證實這一發(fā)現。此外，LAMP技術也已成功應用于患者尿液和唾液中惡性和間日瘧原蟲的檢測，但是同巢式PCR相比，靈敏度較低[15]。然而，基于LAMP技術的簡便、快速、準確、廉價、適于臨床和基層等特點，繼續(xù)提高其用于尿液、唾液中瘧原蟲DNA的檢測效果，對于瘧疾的簡便快速診斷將具有重大意義。

2.1.2 弓形蟲 羊水弓形蟲DNA的PCR檢測或許是先天性弓形蟲病產前診斷的最大進步。這種檢測手段同免疫學、細胞培養(yǎng)和體外接種等方法相比，更加簡便、快捷、精確。Hohlfeld等[16]最早使用PCR技術從孕婦羊水中擴增出剛地弓形蟲DNA，其靈敏度為97.4%，高于傳統病原學診斷方法(89.5%)。Gratzl等[17]通過對實行羊水弓形蟲PCR檢測后的嬰兒進行跟蹤隨訪，證實羊水弓形蟲PCR檢測是一種鑒定或排除嬰兒弓形蟲感染有用的方法。Romand等[18]使用熒光定量PCR技術對孕婦羊水弓形蟲DNA的濃度進行測定，認為其可作為先天性弓形蟲病早期的預后指標，并推斷如果母體妊娠的前20周蟲體負荷超過100/mL (parasites/mL)，將會對嬰兒造成嚴重后果。Azevedo等[19]對孕婦羊水弓形蟲DNA的PCR檢測效果進行系統性評價和Meta分析，得到其全局靈敏度異質性為66.5%，并建議孕后五周進行弓形蟲病診斷篩查。此外，其他學者也在嬰兒腦脊液、尿液[20]和患者眼房水[21]中檢測到了弓形蟲DNA，為弓形蟲病的診斷、預防和控制指明了新方向。

2.1.3 利什曼原蟲 Motazedian等[2]首次將尿液蟲體DNA的PCR檢測用于免疫缺陷型內臟利什曼蟲病人的診斷，結果表明該方法具有高度的靈敏性(96.8%)、特異性(100%)和簡便性，認為可將其作為內臟利什曼蟲病的診斷工具。Fisa等[22]同樣證實該方法在嬰氏利什曼蟲感染活躍期展示出高水平的精確性，并且治療后不同時期的檢測結果同尿液抗原檢測、外周血PCR和細胞培養(yǎng)等其他診斷方法相一致，認為可能對治療效果的監(jiān)控有作用。Veland等[23]在皮膚和黏膜型利什曼蟲病人的尿液中檢測到利什曼蟲動基體DNA (kDNA)，雖然靈敏度(20.9%)較低，但對低程度的組織定位類型和治療方案是有用的。Silva等[24]認為尿液利什曼蟲DNA的質量是PCR成功擴增的關鍵因素，他們通過對內臟利什曼蟲病人尿液利什曼蟲DNA的4種提取方法進行比較，結果顯示苯酚/氯仿乙醇沉淀法在檢測結果和花費方面是最有效的。

2.1.4 錐蟲 Russomando等[3]使用PCR技術在恰加斯病病人血清和全血中均檢測到克氏錐形蟲DNA，但發(fā)現兩者檢測結果沒有差異，同全血樣本相比，血清樣本不需要特殊的化學處理，在流行地區(qū)現場調查中更容易處理和運輸。Castro-Sesquen等[25]發(fā)現在克氏錐蟲感染的豚鼠尿液中存在錐蟲DNA，認為該DNA是由于寄生蟲全身感染產生的，而不是直接來源于腎損傷；如果提高尿液中錐蟲DNA的檢測效果，對先天性、免疫功能不全等恰加斯病患者的診斷將是非常有價值的。Ngotho等[26]使用LAMP技術在感染的猴模型血清、腦脊液、尿液和血漿中檢測到布氏錐蟲DNA，結果顯示LAMP技術在血清樣本中檢測效果最佳，依次為唾液和尿液；在感染后21～77 d內唾液樣本中LAMP檢測率達100%，在感染后28～91 d內尿液樣本中LAMP檢測率均超過80%，在分別超過140 d和126 d兩種樣品均不能檢測到蟲體DNA，該方法強調了使用唾液和尿液樣本進行非洲錐蟲病診斷的重要性。這些研究表明，體液游離錐蟲DNA具備錐蟲病的診斷潛能。

2.1.5 溶組織阿米巴 Parija等[27]證實游離溶組織阿米巴DNA能夠穿透腎小球屏障，通過PCR技術可在阿米巴肝膿腫病人的尿液中檢測到，有可能成為阿米巴肝膿種新型診斷標志物；由于尿液中溶組織阿米巴DNA隨著治療進程逐漸消除，也可將其作為療效評估的預后標志物。Khairnar等[28]使用巢氏多重PCR技術在接受甲硝唑治療的阿米巴肝膿腫病人唾液中檢測到溶組織阿米巴DNA，而未接受甲硝唑治療的病人唾液中沒有檢測到，這可能是由于治療過程中蟲體大量死亡釋放出內部的DNA分子進入患者唾液中。Haque等[29]使用熒光定量PCR技術檢測阿米巴肝膿腫和阿米巴結腸炎病人血液、尿液和唾液中的溶組織阿米巴DNA，靈敏性分別為49%、77%、69%和36%、61%、64%，發(fā)現使用尿液和唾液比血液具有更高的檢測靈敏性。由于在阿米巴肝膿腫形成過程中，糞便寄生蟲難以被檢測，因此，游離溶組織阿米巴DNA在阿米巴肝膿腫篩查和檢測方面是一個很有潛力的診斷工具。

2.2 蠕蟲

2.2.1 班氏絲蟲 微絲蚴檢查是班氏絲蟲病常規(guī)診斷方法，根據微絲蚴夜間出現的周期性，取血時間以晚上9時至次日凌晨2時為宜。然而，夜間取血無疑對班氏絲蟲病的診斷帶來實際的約束，尤其在對流行區(qū)域實行大規(guī)模調查的時候。體液游離微絲蚴DNA的檢測提供了一個很好的解決辦法，因為不論微絲蚴存在何種時期，其游離的DNA是一直存在的。多項研究表明，使用以核酸擴增為基礎的檢測手段可從病人尿液[4,30]、唾液[31-32]、血清[30]等體液中檢測到班氏絲蟲的DNA，其靈敏度和特異度可分別達97.5%和92.4%[31]。這種方法不僅可以在白天很方便地采集標本，而且選用易獲取的尿液、唾液等標本用于診斷，可實現非侵入無痛性操作，更受患者的青睞，尤其在社區(qū)監(jiān)管和疾病控制項目中。

2.2.2 血吸蟲 同其他CFPD相比，體液游離血吸蟲DNA在血吸蟲病診斷中使用的更加廣泛。與糞便或尿液中蟲卵的隨機分布不同，游離血吸蟲DNA在體液中呈均勻分布，因此可簡便地獲取標本用于檢測。這既克服了蟲卵樣本采集的實際限制，又避免了因隨機取樣造成診斷的低準確度。目前已在血漿、血清、唾液、尿液和腦脊液等多種體液中檢測到血吸蟲DNA[33-42]，同時也發(fā)現游離血吸蟲DNA的檢測在現場調查和項目篩查研究中較其它檢測方法顯示出更高的靈敏性和特異性。例如，Kato-Hayashi等[12]對4種血吸蟲病的診斷方法在菲律賓高流行地區(qū)大規(guī)模人群的調查結果進行比較，發(fā)現血清中血吸蟲DNA的PCR檢測靈敏性高達100%，特異度較NW (a network echogenic pattern)、ELISA和KK (Kato-Katz) 法都要高，并且能夠檢測出KK陰性的患者。Lodh等[11]通過對贊比亞地區(qū)人群尿沉淀中曼氏血吸蟲的3種診斷方法進行比較，發(fā)現PCR法(靈敏性100%，特異性100%)比KK(靈敏性50%，特異性100%)和CCA (circulating cathodic antigen) (靈敏性67%，特異性60%)法具有更高診斷的精確性。另外，Harter等[40]提出腦脊液和血清中血吸蟲DNA的檢測對診斷困難的中樞神經系統血吸蟲病感染的確診是有用的。因此，使用游離血吸蟲DNA用于血吸蟲病診斷具有可行性和現實性。

研究發(fā)現游離的血吸蟲DNA在感染早期就能夠被檢測出來，有助于血吸蟲病的早期診斷。Xia等[41]使用PCR技術在感染日本血吸蟲1周后的兔子血清中檢測到蟲體的DNA。Kato-Hayashi等[42]建立了能夠區(qū)分4種血吸蟲的PCR檢測方法，實驗中發(fā)現在感染1 d后的小鼠尿液或血清樣本中就能檢測到相應的血吸蟲DNA。此外，結合體液中游離血吸蟲DNA的含量變化，能夠動態(tài)監(jiān)測血吸蟲病的治療效果。Wichmann等[8]使用熒光定量PCR檢測小鼠模型血漿中血吸蟲DNA，發(fā)現其在吡喹酮治療后被大量清除；而且病人血漿中血吸蟲DNA的濃度也在治療后顯著下降。Kato-Hayashi等[36]使用血清、尿液、精液和唾液中的血吸蟲DNA監(jiān)控1例難治型埃及血吸蟲患者發(fā)現，同尿液中蟲卵的快速消失不同，體液中血吸蟲DNA在4次吡喹酮治療后一直存在。

2.2.3 絳蟲 體液游離絳蟲DNA目前也被用于絳蟲病診斷研究中。Almeida等[43]和Hernández等[44]分別通過PCR和半巢式RCR技術均從腦囊蟲病患者腦脊液中檢測到豬肉絳蟲的DNA。Michelet等[45]通過對腦囊蟲病的不同診斷方法進行比較，發(fā)現腦脊液豬肉絳蟲DNA的PCR檢測能夠檢測出不被影像學或免疫學檢測出的腦囊蟲病，并顯示出較高的靈敏性(95.9%)和特異性(80%～100%)。Yera等[46]使用qPCR技術對腦囊蟲病患者進行隨訪發(fā)現，在治療數月后患者腦脊液中仍能檢測到豬肉絳蟲的DNA。因此，腦脊液豬肉絳蟲DNA具有腦囊蟲病診斷的潛能。另外，Parija等[47]一項研究發(fā)現，在包囊破裂的病人血清中能檢測細粒棘球絳蟲的DNA，而包囊未破裂的病人卻不能，表明細粒棘球絳蟲DNA只有在包囊破裂時才進入循環(huán)系統中；同時沒有發(fā)現任何尿液樣本能夠檢測出棘球絳蟲的DNA，表明血清和尿液標本都不適用于囊型包蟲病的PCR檢測；但是，通過對血清樣本和囊液的PCR檢測將有助于判斷包囊是否破裂。

3 存在問題及展望

開發(fā)CFPD作為寄生蟲病的診斷工具具有重要的理論和實踐意義，但當前仍存在一些顯著性的問題需要我們思考。例如：CFPD是如何產生的？它在宿主體液和組織中是如何分布的？CFPD在宿主體內發(fā)生了哪些生物學變化？對宿主將會造成何種影響？CFPD同原來的寄生蟲基因組DNA相比是否發(fā)生改變以及是否具備某些特殊的生物學功能，這都是值得關注的問題。

CFPD提取方法繁瑣，質量難以保證；PCR等核酸擴增產物易造成實驗室污染并且不易消除，難以保證診斷的精確性；CFPD的含量同疾病程度是否相關仍有待驗證。另外，降低CFPD檢測技術成本也要考慮。

隨著防治工作的開展，許多地區(qū)寄生蟲感染已大為下降。但是傳統的診斷方式有可能低估了實際水平。目前，CFPD用于病原體檢測的研究已廣泛展開，尤其所使用的尿液、唾液等易于采集、分析和處理，在大規(guī)模的流行病學篩查中將帶來顯著性的益處。隨著分子生物學技術的不斷創(chuàng)新和完善，相信可以早日建立快速、靈敏、特異并具有療效考核價值的CFPD檢測方法。

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Research progress of cell-free parasite DNA in the diagnosis of parasitic diseases

HE Shun-wei1, LI Xiao-yan2, ZHAO Rui-xue2, PENG Yuan3, WEI Xiao-xing1,3

(1.DepartmentofEcologically-environmentEngineering,QinghaiUniversity,Xining810016,China;
2.AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810016,China;
3.DepartmentofMedicalCollege,QinghaiUniversity,Xining810016,China)

At present, corresponding cell-free parasite DNA molecules (CFPD) has been detected in serum, plasma, urine, saliva and other bodily fluids of a variety of the patients with parasitic diseases.Due to its high specificity and sensitivity, the CFPD shows a strong advantage of noninvasive diagnosis and continuous monitoring, etc. in parasitic diseases. This article namely reviews the current research of CFPD in the patients with parasitic disease at home and abroad in recent years, so as to provide new ideas for the development direction of parasitic disease diagnosis in the future. The current related problems are discussed in the mean time.

bodily fluid; parasite; cell-free DNA; diagnosis; research progress

Wei Xiao-xing, Email: weixiaoxing@tsinghua.org.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.013

魏曉星，Email：weixiaoxing@tsinghua.org.cn

1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧 810016； 2.青海大學附屬醫(yī)院，西寧 810016； 3.青海大學醫(yī)學院，西寧 810016

R381

A

1002-2694(2017)02-0163-07

2016-08-16 編輯：劉岱偉

青海省科技項目(No. 2016-ZJ-746)資助

Supported by the Science and Technology Project of Qinghai Province (N0. 2016-ZJ-746)