袁嘯天+宋彥璋+劉喆昊+張凱+楊浚哲

摘 要：血細(xì)胞作為細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，與體液免疫因子的提供者，在對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)凡納濱對(duì)蝦感染副溶血性弧菌后，總血細(xì)胞，大顆粒細(xì)胞，小顆粒細(xì)胞與透明細(xì)胞各自的數(shù)量變化與單類血細(xì)胞數(shù)占總血細(xì)胞數(shù)的比例變化，發(fā)現(xiàn)總血細(xì)胞數(shù)，三類血細(xì)胞數(shù)與其各自所占比例在感染的不同時(shí)期發(fā)生了不同程度的變化，大體呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后減少的數(shù)量變化，探索對(duì)蝦的細(xì)胞免疫與弧菌感染力的關(guān)系，為制定高效的對(duì)蝦流行病防控策略提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；血細(xì)胞；大顆粒細(xì)胞；小顆粒細(xì)胞；透明細(xì)胞

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.05.190

1 研究意義和目的

對(duì)蝦弧菌病是對(duì)蝦養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的疾病之一，其中鰻弧菌和副溶血弧菌廣泛存在于自然海水中，具有流行廣、發(fā)病率高、危害大、死亡率高等特點(diǎn)，造成對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，進(jìn)行對(duì)蝦免疫學(xué)研究，為建立高效、健康的對(duì)蝦養(yǎng)殖模式提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。對(duì)蝦的血細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者， 又是體液免疫因子的提供者， 分為透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞三類， 各自擔(dān)負(fù)著不同的免疫功能。在健康對(duì)蝦體內(nèi)三類血細(xì)胞的比例和數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)對(duì)蝦患病后， 三類血細(xì)胞的比例和數(shù)量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。

本課題旨在探索對(duì)蝦的細(xì)胞免疫與弧菌感染力的關(guān)系，為制定高效的對(duì)蝦流行病防控策略提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

健康的凡納濱對(duì)蝦（ Litopenaeus vannamei ） 購(gòu)自南山市場(chǎng)。副溶血性弧菌（ATCC17802）購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心。

抗凝劑（ NaCl 450mM， KCl 10mM， EDTA-Na2 10mM， HEPES 10mM， pH7.3）與血淋巴等滲。

2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

將十組凡納濱對(duì)蝦，每組3尾，分別注射0.1ml不同濃度的副溶血弧菌，記錄各組凡納濱對(duì)蝦的死亡時(shí)間。選擇接近168小時(shí)全部死亡的一組的副溶血弧菌濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如果死亡時(shí)間與理想時(shí)間相差過大，則進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 對(duì)蝦感染試驗(yàn)

選取體長(zhǎng)10cm±0.5cm，體重30g±2g，外觀健康的凡納濱對(duì)蝦，暫養(yǎng)于180L水族箱中。一周后，感染組取30尾注射副溶血性弧菌，對(duì)照組取30尾注射等量生理鹽水。兩組分別飼養(yǎng)，每日投喂飼料一次。實(shí)驗(yàn)過程連續(xù)充氣，水溫為24℃-26℃。

2.4 血樣的制備

注射弧菌后，用配有26號(hào)針頭的1ml注射器從實(shí)驗(yàn)組3尾凡納濱對(duì)蝦與對(duì)照組3尾凡納濱對(duì)蝦的腹血竇處分別取0.4ml血淋巴。

取血前在注射器中裝入0.4ml的抗凝劑（4℃），取血后將血淋巴和抗凝劑的混合物注入裝有0.4ml抗凝劑的離心管中，混勻，混合液用于蝦總血細(xì)胞與單類血細(xì)胞數(shù)的測(cè)量。

2.5 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

取一滴A液加到血球計(jì)數(shù)板上在400倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)血細(xì)胞并計(jì)算蝦總血細(xì)胞與單類血細(xì)胞數(shù)，此后每隔12小時(shí)重復(fù)取血并觀察，直至實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦全部死亡。

3 結(jié)果

3.1 總血細(xì)胞計(jì)數(shù)及比較結(jié)果

72小時(shí)內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)呈上升趨勢(shì)，72小時(shí)后直至對(duì)蝦死亡血細(xì)胞總數(shù)呈下降趨勢(shì)。血細(xì)胞最多時(shí)上升到對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)的232%。108小時(shí)后血樣開始模糊不清，死亡的細(xì)胞數(shù)增多。

3.2 單類血細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)及比較結(jié)果

大顆粒細(xì)胞：60小時(shí)內(nèi)大顆粒細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢(shì)，60小時(shí)后直至對(duì)蝦死亡大顆粒細(xì)胞數(shù)不斷下降。未感染弧菌時(shí)，大顆粒細(xì)胞數(shù)占血細(xì)胞總數(shù)的14.91%，60小時(shí)內(nèi)，其所占比例呈上升趨勢(shì)，最高時(shí)達(dá)到46.74%。此后其所占比例呈下降趨勢(shì)，最后一次測(cè)量時(shí)，比例下降到30.25%。

小顆粒細(xì)胞：84小時(shí)內(nèi)小顆粒細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢(shì)，84小時(shí)后直至對(duì)蝦死亡小顆粒細(xì)胞數(shù)不斷下降。92小時(shí)至120小時(shí)時(shí)下降速度最快。

透明細(xì)胞：72小時(shí)內(nèi)透明細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢(shì)，72小時(shí)后直至對(duì)蝦死亡透明細(xì)胞數(shù)不斷下降。未感染弧菌時(shí)透明細(xì)胞數(shù)在血細(xì)胞總數(shù)中所占比例最大為51.20%，72小時(shí)內(nèi)其所占比例不斷下降，72小時(shí)時(shí)最低，達(dá)到35.22%，此后有所回升，最后一次測(cè)量時(shí)，比例達(dá)到50.65%

4 總結(jié)

對(duì)蝦的三類血細(xì)胞在免疫中具有不同的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)蝦感染弧菌初期，總血細(xì)胞數(shù)量和單類血細(xì)胞數(shù)量都發(fā)生了顯著的升高，說明感染弧菌后三類血細(xì)胞參與了對(duì)抗弧菌的細(xì)胞免疫反應(yīng)。隨著感染時(shí)間的增加，對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著的下降。

可以推斷，對(duì)蝦在抵抗弧菌的過程中，其先天免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為先強(qiáng)后抑的規(guī)律。對(duì)蝦抵抗副溶血性弧菌時(shí)，三類血細(xì)胞數(shù)量和比例上的變化規(guī)律的發(fā)現(xiàn)為制定對(duì)蝦流行病防控的高效策略提供理論依據(jù)，具有重要意義。

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指導(dǎo)老師：姜國(guó)建，白曉歌