鄭毅+梅益生+章新

摘 要：隨著我國(guó)水產(chǎn)加工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生大量的水產(chǎn)下腳料，通過(guò)益生菌發(fā)酵生產(chǎn)微生物菌肥，是實(shí)現(xiàn)下腳料高質(zhì)化應(yīng)用的重要方向。該研究通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化魚(yú)下腳料培養(yǎng)基的組分，經(jīng)單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定乳酸菌發(fā)酵魚(yú)下腳料的培養(yǎng)基為：魚(yú)下腳料300g/L、紅糖100g/L、K2HPO4 2g/L和CaCO315g/L。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；魚(yú)下腳料；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào) TS254.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）04-0017-03

我國(guó)的水產(chǎn)加工品占水產(chǎn)總量?jī)H為30.7%[1]，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家的70%[2]。隨著水產(chǎn)加工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生了越來(lái)越多的水產(chǎn)下腳料，這些水產(chǎn)下腳料富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，如果不進(jìn)行恰當(dāng)?shù)奶幚?，不僅會(huì)造成資源的浪費(fèi)，而且會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染。近年來(lái)，以益生菌發(fā)酵技術(shù)處理水產(chǎn)下腳料以達(dá)到綜合利用的目標(biāo)，如國(guó)外已有利用乳酸菌發(fā)酵加工對(duì)蝦廢棄物方面的研究[4-5]。利用乳酸菌發(fā)酵回收蝦加工廢棄物中的蛋白質(zhì)[6]，不僅提高了蛋白質(zhì)的提取率，而且有效去除了產(chǎn)品中的苦澀味和腥臭味，同時(shí)發(fā)酵后處理簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。曾少葵等用乳酸菌對(duì)羅非魚(yú)酶解液進(jìn)行發(fā)酵[7]，表明乳酸發(fā)酵能有效減弱酶解液的腥味，同時(shí)發(fā)酵后增加的酯類、辛酸及十六醛等物質(zhì)能明顯改善酶解液的風(fēng)味。本研究在優(yōu)選乳酸菌的基礎(chǔ)上，以魚(yú)下腳料為主要原料，進(jìn)行糖、無(wú)機(jī)鹽、磷源的培養(yǎng)基組分優(yōu)化，以期提升乳酸菌發(fā)酵水平（菌數(shù)），實(shí)現(xiàn)高效生物轉(zhuǎn)化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 魚(yú)下腳料制備 從水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)得廉價(jià)小雜魚(yú)，加適量水（固液比1∶2），組織搗碎機(jī)搗碎制成。

1.1.2 菌種 優(yōu)選乳酸菌MS，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）MRS培養(yǎng)基（%）：牛肉膏1，蛋白胨1，酵母膏0.5，葡萄糖2，吐溫80 0.1，磷酸氫二鉀0.2，醋酸鈉0.5，檸檬酸鈉0.5，檸檬酸二銨0.2，硫酸鎂0.058，硫酸錳0.025，瓊脂1.5～2，pH6.2～6.6，121℃、滅菌20min[5]。（2）初始設(shè)計(jì)魚(yú)下腳料發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：下腳料20，紅糖2，磷酸氫二鉀0.2，碳酸鈣1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 由活化的乳酸菌斜面接一環(huán)至MRS液體培養(yǎng)基，37℃，50r/min，24h，制成乳酸菌種子液。

1.2.2 培養(yǎng)基單因素成分優(yōu)化

1.2.2.1 下腳料濃度的優(yōu)化 分別把下腳料培養(yǎng)基配制成150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、400g/L濃度的魚(yú)下腳料的培養(yǎng)基，其他條件不變，發(fā)酵48h后稀釋涂布，計(jì)算菌體數(shù)量，確定最佳的下腳料濃度。

1.2.2.2 紅糖濃度的優(yōu)化 分別在培養(yǎng)基中加入10g/L、20g/L、30g/L、50g/L、80g/L濃度的紅糖，其他條件不變，發(fā)酵48h后稀釋涂布，計(jì)算菌體數(shù)量，確定最適合乳酸菌生長(zhǎng)的紅糖濃度。

1.2.2.3 磷酸氫二鉀濃度的優(yōu)化 分別在培養(yǎng)基中加入1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L濃度的K2HPO4，其他條件不變，發(fā)酵48h后稀釋涂布，通過(guò)計(jì)算后的乳酸菌菌體數(shù)量，研究最適合乳酸菌生長(zhǎng)的K2HPO4濃度。

1.2.2.4 碳酸鈣濃度的優(yōu)化 分別在培養(yǎng)基中加入5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L濃度的CaCO3，其他條件不變，發(fā)酵48h后稀釋涂布，通過(guò)計(jì)算后的乳酸菌的菌體數(shù)量，研究最適合乳酸菌生長(zhǎng)的CaCO3濃度。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取設(shè)計(jì)4種組分：下腳料、紅糖、磷酸氫二鉀、碳酸鈣的濃度進(jìn)行4因素3水平共9個(gè)實(shí)驗(yàn)組的正交實(shí)驗(yàn)，其他條件不變，發(fā)酵48h后稀釋涂布，通過(guò)計(jì)算后的乳酸菌菌體數(shù)量，來(lái)確定乳酸菌生長(zhǎng)最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基單因素成分優(yōu)化

2.1.1 下腳料的濃度對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響 以水產(chǎn)下腳料為主體原料，改變培養(yǎng)基中下腳料濃度，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，最初隨著魚(yú)下腳料濃度的增加，乳酸菌數(shù)也隨之增加，當(dāng)魚(yú)下腳料的濃度為250g/L時(shí)，乳酸菌的數(shù)量最多，達(dá)到0.187億個(gè)/mL，而后隨著下腳料濃度增加，活菌數(shù)略有降低但變化不大，所以無(wú)論從經(jīng)濟(jì)適用角度還是實(shí)驗(yàn)最優(yōu)考慮，選用下腳料的濃度為250g/L的培養(yǎng)基發(fā)酵乳酸菌效果最佳。

2.1.2 紅糖的濃度對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響 魚(yú)下腳料的濃度為250g/L的培養(yǎng)基，分別加入不同濃度紅糖，發(fā)酵后，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，紅糖作為碳源，隨著紅糖濃度的增加，乳酸菌數(shù)也隨之增加，當(dāng)紅糖的濃度為80g/L時(shí)，乳酸菌的數(shù)量最大為6.7億個(gè)/mL。所以選用紅糖的濃度為80g/L的培養(yǎng)基發(fā)酵乳酸菌效果最佳。

2.1.3 磷酸氫二鉀濃度對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響 魚(yú)下腳料的濃度為250g/L、紅糖的濃度為80g/L的培養(yǎng)基，分別加入不同濃度磷酸氫二鉀，發(fā)酵后，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，在磷酸氫二鉀濃度為2g/L是乳酸菌數(shù)達(dá)到峰值6.12億個(gè)/mL，而后隨著磷酸氫二鉀濃度的增加乳酸菌數(shù)緩慢增長(zhǎng)，但最終也未超過(guò)濃度為2g/L時(shí)的乳酸菌菌體數(shù)，從經(jīng)濟(jì)適用角度和已知實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)角度考慮，培養(yǎng)基中加入的磷酸氫二鉀濃度為2g/L是最優(yōu)選擇。

2.1.4 碳酸鈣濃度對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響 魚(yú)下腳料的濃度為250g/L、紅糖的濃度為80g/L、磷酸氫二鉀濃度為2g/L的培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的碳酸鈣，發(fā)酵后，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著碳酸鈣濃度的增加，乳酸菌數(shù)也隨之增長(zhǎng)，在碳酸鈣濃度為20g/L時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)乳酸菌活菌數(shù)為9.8億個(gè)/mL。由此得出碳酸鈣濃度20g/L時(shí)發(fā)酵乳酸菌效果最佳。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基 選取培養(yǎng)基4種組分：下腳料、紅糖、磷酸氫二鉀和碳酸鈣濃度等因素進(jìn)行4因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定發(fā)酵乳酸菌效果最佳的魚(yú)下腳料發(fā)酵培養(yǎng)基，正交設(shè)計(jì)如表1所示。

從表2極差值的分析可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基4種組分對(duì)乳酸菌發(fā)酵水平（活菌數(shù)量）影響大小依次為B>C>A>D，即紅糖的濃度>磷酸氫二鉀濃度>魚(yú)下腳料的濃度>碳酸鈣濃度。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳組合為A3B3C2D1，即發(fā)酵魚(yú)下腳料的濃度為300g/L、紅糖的濃度為100g/L、磷酸氫二鉀濃度為2g/L、碳酸鈣濃度為15g/L，最終乳酸菌數(shù)量達(dá)到9.5億個(gè)/mL。

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