李秀麗，劉文豪，王 磊

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州，234000

核盤(pán)菌Ⅲ型聚酮合酶基因SspksⅢ的克隆與生物信息學(xué)分析

李秀麗，劉文豪，王 磊

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州，234000

首先利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出一個(gè)核盤(pán)菌的Ⅲ型PKS基因，而后將該片段克隆到T載體中進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并將其命名為SspksⅢ。同時(shí)，利用生物信息學(xué)技術(shù)，從理化性質(zhì)、疏水性、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等方面對(duì)該基因編碼蛋白SpksⅢ進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明：SspksⅢ蛋白的相對(duì)分子量為49031.8，理論等電點(diǎn)為5.54，氨基酸數(shù)目為456，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，磷酸化位點(diǎn)主要在絲氨酸殘基上，不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白，在二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋占主要部分。

核盤(pán)菌；聚酮合酶；基因克??；生物信息學(xué)

聚酮化合物是一大類重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在植物、細(xì)菌、真菌等生物中廣泛存在，具有多種重要的生物學(xué)功能。在生物體內(nèi)，該類化合物由聚酮合酶(Polyketide synthases，PKS)催化合成[1]。PKS以脂酰CoA為底物，通過(guò)重復(fù)的脫羧縮合過(guò)程產(chǎn)生線性聚酮化合物或成環(huán)形成環(huán)狀的酮內(nèi)酯。根據(jù)結(jié)構(gòu)，PKS可分為3種類型[2]：Ⅰ型 PKS，先由多個(gè)催化功能域共價(jià)連接組成模塊，而后多個(gè)模塊一起構(gòu)成多功能酶復(fù)合物；Ⅱ型PKS，各個(gè)催化功能域?yàn)楠?dú)立的蛋白；Ⅲ型PKS大多由酮縮合酶構(gòu)成，并且在催化聚酮鏈的延伸過(guò)程中不依賴?；鵆oA載體蛋白[2]。真菌中的PKS較早被人們認(rèn)識(shí)的是由多個(gè)與Ⅰ型PKS相似的催化結(jié)構(gòu)域所組成的巨型多功能蛋白，因此起初真菌的PKS被歸為重復(fù)性Ⅰ型PKS[3]。2005年，在真菌米曲霉中首次發(fā)現(xiàn)了Ⅲ型PKS，接著在曲霉菌、稻瘟病菌、粗糙脈孢菌等真菌基因組中發(fā)現(xiàn)假定的Ⅲ型PKS基因[4]。研究表明，粗糙脈孢菌Ⅲ型PKS以長(zhǎng)鏈酰基CoA為起始物，結(jié)合丙二?；鵆oA進(jìn)行延伸，合成吡喃酮、間苯二酚、二羥基苯甲酸[5]。相對(duì)于Ⅰ型PKSs來(lái)說(shuō)，在真菌基因組中，Ⅲ型PKS在數(shù)量上要少得多，但這些酶類發(fā)揮著非常重要的作用[6]。因此，研究真菌中Ⅲ型PKS的功能，了解它在真菌代謝和致病過(guò)程中的作用，對(duì)防治由真菌引起的病害具有重要的意義。

本研究以油菜菌核病的病原菌核盤(pán)菌為研究對(duì)象。首先運(yùn)用RT-PCR方法克隆到該菌基因組中一個(gè)Ⅲ型PKS基因，而后利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其編碼蛋白的氨基酸組成、理化性質(zhì)、疏水性與親水性、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方面進(jìn)行初步分析，從而為后續(xù)的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)以核盤(pán)菌NGA4(由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院真菌研究室提供)無(wú)性發(fā)育階段的菌絲為材料；實(shí)驗(yàn)中所用的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DG5α、TaqDNA聚合酶、pMD18-T vector、DNase I、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；提取RNA用的E.Z.N.A.TM Total RNA Kit I試劑盒由美國(guó)Omega Bio-Tek公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad Power-Pac 300電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；Eppendorf AG-22331 PCR自動(dòng)系列化分析儀(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-QBiocel純水儀(美國(guó)Millipore公司)；ZHWY-103B恒溫培養(yǎng)震蕩器(上海智成分析儀器制造有限公司)；Bio-Rad PTC240 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 總RNA的提取與cDNA合成

將新鮮核盤(pán)菌NGA4菌絲在液氮中速凍，而后利用RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取。將提取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNase酶切進(jìn)行預(yù)處理，以充分去除污染的基因組DNA，而后將所得產(chǎn)物在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的催化下進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)與基因SspksⅢ的克隆

用以下兩個(gè)寡核苷酸作引物對(duì)基因SspksⅢ進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物SspksⅢ-F:5′-ATGCCCAGCAATCCGCCAAC-3′，下游引物SspksⅢ-R: 5′-TTAGT CCAGCTGCACACCATT-3′。以核盤(pán)菌NGA4菌絲階段的cDNA為模板，克隆基因SspksⅢ。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸70 s，32個(gè)循環(huán)，10℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)并回收后，連接至pMD18-T vector上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DG5α，然后在具有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上過(guò)夜得到單菌落。對(duì)經(jīng)PCR驗(yàn)證成功的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.5 基因SspksⅢ的生物信息學(xué)分析

對(duì)SspksⅢ基因編碼蛋白SspksⅢ進(jìn)行如下幾個(gè)方面的分析預(yù)測(cè)。利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行氨基酸組成和理化性質(zhì)分析，運(yùn)用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行疏水性分析，利用Protcomp9.0(http: //www.softberry.com/berry. phtml? topic=protcomppl&group= programs & subgroup=proloc)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用TMHMM Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜分析，利用NetPhos2.0(http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析，運(yùn)用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析，利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，利用Swiss-model(http: //swiss model.expasy.org/)工具進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤(pán)菌基因SspksⅢ的克隆

提取的RNA如圖1所示。28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍且沒(méi)有降解，說(shuō)明提取的RNA完整性較好，可用作為反轉(zhuǎn)錄模板，合成cDNA。然后以SspksⅢ-F、SspksⅢ-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2。各泳道在大約1400 bp的位置都有清晰單一的條帶，將條帶回收，經(jīng)大腸桿菌克隆后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，所克隆到的基因序列同學(xué)界公布的序列一致(http://www.Broad institute.org/annotation/genome/sclerotinia_sclerotiorum/MultiHome.html)。

圖1 總RNA電泳圖

圖2 SspksⅢ cDNA電泳圖

2.2 蛋白SspksⅢ的生物信息學(xué)分析2.2.1 氨基酸組成與理化性質(zhì)

SspksⅢ蛋白的氨基酸組成種類、數(shù)目、所占百分比如表1所示。由表1可知，SspksⅢ蛋白帶負(fù)電荷殘基數(shù)量(Asp+Glu)為57，帶正電荷殘基數(shù)量(Arg+Lys)為42；該蛋白質(zhì)含有2137個(gè)碳原子，3436個(gè)氫原子，596個(gè)氮原子，674個(gè)氧原子和24個(gè)硫原子，分子式C2137H3436N596O674S24；相對(duì)分子量為49031.8，理論等電點(diǎn)為5.54，氨基酸數(shù)目為456，其中，酸性氨基酸(DE)占13.6%，堿性氨基酸(KR)占9.2%，中性氨基酸占78.2%。在組成SspksⅢ蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸占比最高，達(dá)到9.9%，色氨酸占比最低，僅為0.9%。在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為41.78，提示該蛋白為不穩(wěn)定；脂肪族氨基酸指數(shù)為87.46，總平均疏水指數(shù)為-0.171。

表1 SspksⅢ蛋白的氨基酸組成

2.2.2 疏水性

運(yùn)用ProtScale軟件分析得到SspksⅢ蛋白的疏水性特點(diǎn)，見(jiàn)圖3。由圖3可以看出SspksⅢ蛋白在152位氨基酸有一個(gè)親水性峰，峰值為2.2，疏水性峰在440位氨基酸，峰值為-2.5，故推測(cè)該蛋白可能為疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)。

2.2.3 亞細(xì)胞定位分析

利用Protcomp9.0對(duì)SspksⅢ蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析(表2)，由表2可知，該蛋白分布于細(xì)胞核(1.13)、細(xì)胞質(zhì)(6.67)可能性較大，分布于細(xì)胞外、質(zhì)膜、線粒體、溶酶體、高爾基體的可能性較小，而分布于細(xì)漿和液泡的可能性為0，因此推斷SspksⅢ蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

表2 SspksⅢ的亞細(xì)胞定位

圖3 SspksⅢ疏水性分析

2.2.4 跨膜區(qū)

利用TMHMM Server 2.0對(duì)SspksⅢ蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明該蛋白不具有跨膜區(qū)，說(shuō)明它不是跨膜蛋白，推測(cè)主要在基質(zhì)中發(fā)揮作用。

圖4 SspksIII蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.2.5 磷酸化位點(diǎn)

磷酸化是蛋白翻譯后的最普遍的修飾方式，SspksⅢ蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)如圖5。由圖5可知，絲氨酸數(shù)目為21個(gè)，蘇氨酸數(shù)目為8個(gè)，酪氨酸數(shù)目為3個(gè)，由此可以判斷該蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要在絲氨酸位點(diǎn)上，部分在蘇氨酸和酪氨酸上。

圖5 SspksⅢ的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2.6 信號(hào)肽分析

用Signal-P軟件分析得出信號(hào)肽分析圖(圖6)，可見(jiàn)信號(hào)肽分值都低于0.5，由此可推測(cè)該基因所編碼的蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。

圖6 SspksⅢ的信號(hào)肽分析

2.2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)表4。由4表可以看出，SspksⅢ蛋白主要由三種二級(jí)結(jié)構(gòu)形式組成，其中，無(wú)規(guī)則卷曲占46.27%，α螺旋占36.62%，伸展鏈占17.11%，不含β折疊結(jié)構(gòu)。

表3 SspksⅢ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.8 三級(jí)結(jié)構(gòu)

SspksⅢ蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模(圖7)顯示，SspksⅢ存在較多的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和α螺旋結(jié)構(gòu)，同二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

4 討 論

聚酮化合物具有結(jié)構(gòu)和功能的多態(tài)性，其中不乏具有生物活性和重要藥用價(jià)值的活性物質(zhì)，比如抗真菌劑灰黃霉素和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑、抗寄生蟲(chóng)抗生素除蟲(chóng)菌素和莫能菌素、免疫抑制劑雷帕霉素等[7]。研究Ⅲ型PKS可以為人工合成某些次生代謝提供依據(jù)[8-9]。Ⅲ型PKS在植物、細(xì)菌、真菌中都存在，而現(xiàn)有的研究多集中于植物和細(xì)菌方面，而對(duì)真菌中的Ⅲ型PKS研究較少[10-11]，故對(duì)該類蛋白進(jìn)行深入的研究具有一定的理論意義和實(shí)踐意義。

圖7 SspksⅢ蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

本研究利用RT-PCR方法對(duì)核盤(pán)菌假定PKS基因SspksⅢ進(jìn)行克隆，并在此基礎(chǔ)之上對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：SspksⅢ蛋白為疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，不具跨膜結(jié)構(gòu)，不含有信號(hào)肽，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，據(jù)此可以判定SspksⅢ蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)揮催化功能。另外，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋占36.62%、伸展鏈占主要部分。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.01.032

2016-08-28

宿州區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心全國(guó)開(kāi)放課題“夾溝香稻米的香味基因的克隆與序列特異性研究”(2014SZXTKF04ZD)。

李秀麗(1980-)，女，山東濟(jì)寧人，博士，講師，研究方向：植物病原真菌病害。

Q71

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1673-2006(2017)01-0117-05