任 力, 邢 進(jìn), 魏子龍, 王之涵, 趙 亮,邱永明, 林盈盈

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399;2. 上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在腦缺血模型中的表達(dá)意義

任 力1, 邢 進(jìn)1, 魏子龍1, 王之涵1, 趙 亮1,邱永明2, 林盈盈2

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399;2. 上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

目的 探討谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在腦缺血模型中的表達(dá)意義。方法 在體內(nèi)缺血、體外缺氧2種模型中利用免疫熒光、Westen-blot、RT-PCR等技術(shù)定性定量的檢測(cè)主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(EAAC-1)和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GAT-1)的表達(dá)情況。結(jié)果 在局灶性腦缺血模型(大鼠腦中動(dòng)脈缺血模型)和缺氧條件下培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中均發(fā)現(xiàn), EAAC1表達(dá)下降, GAT1表達(dá)上升。結(jié)論 在腦缺血缺氧狀態(tài)下EAAC1表達(dá)下降, GAT1表達(dá)上調(diào)。

腦缺血; 缺氧; 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1; γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1

缺血缺氧是導(dǎo)致癲癇、中風(fēng)等神經(jīng)生理疾病發(fā)生的主要原因之一，具有較高致死率、致殘率[1]。L-谷氨酸因腦缺血缺氧過度釋放，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元死亡[2]。同時(shí), γ-氨基丁酸(GABA)受體活化以抑制L-谷氨酸過度釋放[3]。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)同作用，共同維持細(xì)胞外GABA和谷氨酸的含量，參與正常神經(jīng)元活動(dòng)及大腦的多種病理狀態(tài)[4]。目前，關(guān)于這兩種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在腦缺血性疾病中的具體表達(dá)尚不明確。本研究通過建立大鼠腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型，探討谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(EAAC-1)及γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GAT-1)在體內(nèi)外缺血缺氧條件下的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 大鼠MCAO模型的建立

健康成年雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量250～300 g, 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，食物和水隨意提供，設(shè)置12、12 h日夜周期。本研究采用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并依據(jù)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。

SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(手術(shù)但無栓塞)與觀察組，每組8只。觀察組腦缺血24 h后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，按照文獻(xiàn)[4]對(duì)大鼠進(jìn)行再灌注。具體操作如下: 1根單絲尼龍線與熱處理后的圓尖通過頸外動(dòng)脈引入右頸內(nèi)動(dòng)脈，直到到達(dá)一個(gè)輕微的阻力處，維持90 min后撤回，以便再灌注。再灌注開始的特定時(shí)間，采用戊巴比妥鈉腹腔注射100 mg/kg將動(dòng)物深度麻醉。大鼠心臟灌流4 ℃生理鹽水后，在冰上解剖獲取相應(yīng)的缺血中心區(qū)和半暗帶區(qū)腦組織，用于組織mRNA和蛋白的分析。大鼠心臟灌注4 ℃生理鹽水后, 4%多聚甲醛(pH=7.4)灌流固定腦組織。取腦組織, 4% PFA固定，低溫保存于20%、30%蔗糖溶液中。在-1.80和-4.80 mm間的前囟水平行連續(xù)冠狀切片，共收集24個(gè)切片進(jìn)行染色。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

原代神經(jīng)元在含有10% FBS(PAA，Linz，Austria)DMEM中培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。為模擬體內(nèi)缺氧環(huán)境，將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用CoCl2處理培養(yǎng)的神經(jīng)元24、48 h后，采用免疫印跡法和RT-PCR法觀察EAAC1和GAT1的表達(dá)情況。

1.3 免疫熒光

采用4%多聚甲醛于4 ℃下固定含有細(xì)胞的玻片15 min, 并使用含有0.1%皂素、1%羊血清或2%驢血清的PBS溶液室溫下孵育30 min。加入相應(yīng)的小鼠EAAC1、GAT1一抗，稀釋500倍, 4 ℃孵育過夜。吸去一抗，洗滌玻片，使用Alexa-Fluor-488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗，室溫避光孵育2 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Trizol法抽提RNA, 并用DNA酶去除樣本中的DNA。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, GAPDH作為引物內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，重復(fù)3次，采用7900HT快速實(shí)時(shí)PCR機(jī)進(jìn)行分析。

1.5 免疫印跡分析法

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸化抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白。吸取適量蛋白上樣至10%～15%聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。一抗孵育過夜，適當(dāng)濃度的二抗孵育1 h。添加ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，使用柯達(dá)膠片曝光。一抗為EAAC1、GAT1, Actin為蛋白內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 EAAC1、GAT1在大鼠MCAO再灌注模型半暗帶區(qū)的表達(dá)

采用免疫熒光法觀察EAAC1、GAT1在半暗帶區(qū)的表達(dá)，結(jié)果顯示，觀察組再灌注24 h后, EAAC1蛋白表達(dá)相比于對(duì)照組明顯減少, GAT1蛋白表達(dá)相比于對(duì)照組增加。見圖1。

圖1 大鼠腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型中EAAC1和GAT1表達(dá)

2.2 EAAC1、GAT1在缺氧刺激下的神經(jīng)元中的表達(dá)

CoCl2處理24、48 h后，神經(jīng)元EAAC1蛋白表達(dá)下調(diào)，并呈時(shí)間依賴性(圖2A), GAT1蛋白表達(dá)上調(diào)(圖2B); RT-PCR法檢測(cè)EAAC1和GAT1的mRNA水平, CoCl2處理24、48 h后, EAAC1 mRNA水平下調(diào)(圖2C), GAT1 mRNA水平上調(diào)(圖2D)。見圖2。

圖2 EAAC1和 GAT1在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元中的表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷由多因素共同作用所致，其中興奮性氨基酸毒性、梗死周圍去極化、炎癥和凋亡是引起神經(jīng)元死亡的主要病理生理機(jī)制，構(gòu)成了腦缺血再灌注損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5-6]。谷氨酸為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，具有神經(jīng)毒性作用。GABA為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與大腦多種病理狀態(tài)，尤其是腦缺血性疾病和癲癇[7-8]。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體家族含5個(gè)成員，分別是GLAST/EAAT1、GLT-1/EAAT2、EAAC1/EAAT3、EAAT4和EAAT5[9]。研究[10-11]證明，消除GLT-1的小鼠發(fā)生嚴(yán)重癲癇，可見GLT-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。與GLT-1相比，EAAC1在神經(jīng)元死亡中的作用尚未明確。除了介導(dǎo)細(xì)胞外谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)，最新研究[12]發(fā)現(xiàn)EAAC1可作為半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體從而發(fā)揮作用，并維持神經(jīng)元的谷胱甘肽代謝。因此，推測(cè)EAAC1可能在維持谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)外，還發(fā)揮著其他重要的作用。鈉-氯離子依賴性GAT1主要負(fù)責(zé)將GABA從神經(jīng)傳遞的突觸間隙去除，從而終止了GABA神經(jīng)傳遞的作用[13]。

本研究中, EAAC1在局灶性腦缺血MCAO模型及缺氧條件下培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中的表達(dá)均降低, GAT-1的表達(dá)輕度升高，與國內(nèi)研究[14]結(jié)果一致?？梢娔X缺血再灌注后谷氨酸的神經(jīng)毒性及GABA的神經(jīng)保護(hù)作用, EAAC-1可通過調(diào)節(jié)谷氨酸水平保護(hù)神經(jīng)元損傷。本研究還發(fā)現(xiàn), CoCl2處理后，大量的神經(jīng)元凋亡，可見缺氧和能量不足所致的細(xì)胞凋亡是腦缺血缺氧損傷的重要發(fā)病機(jī)制。

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Significance of expressions of glutamate transporters and γ-aminobutyric acid transporters in rat model with cerebral ischemia

REN Li1, XING Jin1, WEI Zilong1, WANG Zhihan1, ZHAO Liang1,QIU Yongming2, LIN Yingying2

(1.DepartmentofNeurosurgery,ShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399; 2.DepartmentofNeurosurgery,RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127)

Objective To explore the significance of expressions of glutamate transporters and γ-aminobutyric acid transporters in the rat model with cerebral ischemia. Methods The detections of the expressions of glutamate transporter-1 (EAAC-1) and γ-aminobutyric acid transporter -1 (GAT-1) in models with ischemia in vivo and hypoxia in vitro were performed by immunofluorescence, Westen-blot and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) methods. Results The expression of EAAC1 was reduced in the cerebrum of focal cerebral ischemic MACO rat model as well as in primary neurons cultured under hypoxia. The expression of GAT1 was elevated. Conclusion EAAC1 expression decreases while GAT1 expression increases under condition of cerebral ischemia and anoxia.

cerebral ischemia; anoxia; glutamate transporter-1; γ-aminobutyric acid transporter -1

2016-11-20

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)面上項(xiàng)目(201540412); 上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)藥科研基金

魏子龍, E-mail: weizilong2007@163.com

R 743

A

1672-2353(2017)03-048-04

10.7619/jcmp.201703015

課題(2014JP025A); 上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(PWZz2013-18)