陳 程，羅國平，張存勞，閆夢茹

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

白術(shù)為菊科植物,白術(shù)的干燥根莖，具有燥濕利水、健脾益氣、止汗安胎的功效[1]。白術(shù)多糖為白術(shù)主要化學(xué)成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明白術(shù)多糖具有抗應(yīng)激、抗氧化、抗衰老等作用[2-4]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，白術(shù)多糖的純化方法大多數(shù)采用水提醇沉法，此方法存在除雜效率低、有效成分損失大的缺點。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑是一種天然高分子物質(zhì)，主要以天然多糖為原料，是一種新型的食品添加劑，由a和b兩組分組成，其原理是分別加入兩組分后，不同的可溶性大分子間架橋連接進(jìn)而形成絮狀物，主要用于除去藥液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等成分，進(jìn)而保留藥液中的多糖、高分子物質(zhì)等[7]。研究表明[8-11]Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑已應(yīng)用于黃芪多糖、土茯苓多糖等中藥的提純工藝中，效果良好。因此，作者通過單因素和正交實驗設(shè)計，對Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑純化白術(shù)多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為白術(shù)多糖下一步研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

白術(shù)：陜西誠合藥業(yè)有限公司；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號20160918，上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號Y21N656172，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)-G250：批號20144594，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Ⅱ型ZTC1+1天然澄清劑：天然高分子材料，由a和b兩組分組成，天津振天成科技有限公司；苯酚、乙醇、硫酸等：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

紫外可見分光光度計：Cary-60，美國安捷倫公司；液體真空濃縮煎藥機(jī)：YZN50，北京東華原公司；電子天平： SQP，賽多科斯科學(xué)儀器有限公司；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；臺式離心機(jī)：TD5M，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZ9147，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；恒溫磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 白術(shù)多糖粗提液的制備

稱取白術(shù)藥材1 kg，粉碎，置于液體真空濃縮煎藥機(jī)，加入10倍量水浸泡1 h，加熱回流提取2次，每次1 h，提取溫度80 ℃，壓力為0.02～0.04 kPa。合并2次提取液并用紗布過濾，濾液再次離心(3 500 r/min)，取上清液置于真空濃縮煎藥機(jī)中減壓濃縮至0.5 g/mL(每mL中含生藥的質(zhì)量)，即得白術(shù)多糖粗提液，備用。

1.3 澄清劑優(yōu)化工藝流程

a組分用蒸餾水配制成體積分?jǐn)?shù)為1%黏膠溶液，b組分用乙酸配成體積分?jǐn)?shù)為1%黏膠溶液，分別溶脹24 h，紗布過濾。按照實驗設(shè)計，量取相應(yīng)質(zhì)量濃度的多糖提取液25 mL于錐形瓶中，水浴加熱至實驗溫度，首先加入組分b，再加入組分a，兩組分均攪拌加入(60 r/min)，按照實驗時間取出，離心(15 min，3 500 r/min)，測定上清液中多糖和蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而計算多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

1.4 澄清工藝單因素實驗考察

選取藥液比[m(白術(shù))∶V(水)，下同]，澄清劑用量[V(b)∶V(a)∶V(藥液)，下同]、水浴溫度、水浴時間為考察因素，按照實驗設(shè)計考察單因素不同水平對澄清效果的影響，并以澄清效果、沉淀情況、多糖保留率、蛋白質(zhì)清除率為評價指標(biāo)。

1.5 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取實驗因素，以多糖保留率、蛋白質(zhì)清除率、固形物清除率為評價指標(biāo)，分別選取最佳的3水平，并按L9(34)正交表進(jìn)行實驗，優(yōu)化澄清工藝條件。

1.6 多糖含量的測定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取D-葡萄糖對照品10 mg，加水適量溶解并定容至50 mL，即得D-葡萄糖對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容至2.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚1.0 mL，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，30 ℃水浴中加熱15 min，取出，冷卻后在490 nm處測定吸光度(A)。以水作為空白，以葡萄糖質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 顯色穩(wěn)定性實驗

精密吸取樣品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，按“1.6.1”方法顯色，分別于0、1、2、3、4、6 h測吸光度。

1.6.3 樣品多糖含量測定

精密吸取樣品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，按“1.6.1”方法顯色，測得吸光度，測定澄清劑處理前后的多糖含量，進(jìn)而計算多糖保留率。

1.7 蛋白質(zhì)的測定

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取牛血清蛋白50.0 mg置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得牛血清蛋白貯備液(0.50 mg/mL)。吸取上述貯備液50 mL置于250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得100 mg/L蛋白對照溶液。精密吸取上述對照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL 容量瓶中，加水稀釋至1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液顯色劑5.0 mL，混勻后，待其反應(yīng)3～5 min，以蒸餾水為空白，在595 nm處測定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 顯色穩(wěn)定性實驗

精密吸取供試品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“1.7.1”方法，分別在0、1、2、3、4、6h測吸光度。

1.7.3 樣品蛋白質(zhì)含量測定

精密吸取樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“1.7.1”方法顯色，測得吸光度，測定澄清劑處理前后的蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而計算蛋白質(zhì)清除率。

1.8 固形物去除率的測定

精密量取澄清處理前后提取液各10 mL，置已干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h迅速置于干燥器中冷卻，30 min后精密稱量。計算固形物去除率，按下式公式計算：固形物去除率=(澄清前固形物質(zhì)量-澄清后固形物質(zhì)量)/澄清前固形物質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=24.688 9ρ-0.081 2(r=0.999 5)，表明葡萄糖在8.16～28.56 mg/L與吸光度呈良好的線性關(guān)系。顯色穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明樣品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.55%(n=5)。

2.1.2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=16.615 9ρ-0.334 9(r=0.994 3)，表明牛血清蛋白在2.0～10 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。顯色穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明樣品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.26%(n=5)。

2.2 單因素實驗結(jié)果

單因素實驗設(shè)計與結(jié)果見表1。

由表1可知，藥液比、澄清劑用量、水浴溫度、水浴時間對澄清效果影響較大，單因素實驗結(jié)果見表1，故選擇4個因素的較優(yōu)水平為正交實驗的水平。

1) 其它條件為V(b)∶V(a)∶V(藥液)=4∶2∶100，t=50 ℃，t=30 min；2) 其它條件為藥液比=1∶5 g/mL，t=50 ℃，t=30 min；3) 其它條件為藥液比=1∶5 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(藥液)=2∶1∶100，t=30 min；4) 其它條件為藥液比=1∶5 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(藥液)=2∶1∶100，t=50 ℃。

2.3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果進(jìn)行正交實驗的設(shè)計，選取藥液比(A)、澄清劑用量(B)、水浴溫度(C)、水浴時間(D)為考察因素，以多糖保留率(Y1)、蛋白質(zhì)清除率(Y2)、固形物清除率(Y3)的綜和評分為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)依次為0.4、0.4、0.2，綜合評分Y=Y1/Y1max×0.4+Y2/Y2max×0.4+Y3/Y3max×0.2。實驗因素與水平表見表2，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平表

表3 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

由表3、表4可知，各因素影響順序依次為A>C>B>D，其中A、C、B影響顯著，最佳澄清工藝條件為A3B3C1D2，結(jié)合方差分析結(jié)果和節(jié)約成本，故選擇最佳工藝條件為A3B3C1D1，即藥液比1∶15 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(藥液)=10∶5∶100，水浴溫度50 ℃，水浴時間20 min。按照上述條件進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見表5。

表5 驗證實驗

由表5可知，多糖保留率98.74%，蛋白質(zhì)清除率85.34%，固形物去除率30.62%，其結(jié)果均優(yōu)于正交實驗設(shè)計表中的各組。

2.4 水提醇沉法對照驗證實驗

量取多糖粗提液50 mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇使其含醇量達(dá)60%，靜置24 h，離心過濾，濾液濃縮至無醇味，加熱水定容至50 mL，待其室溫，測定醇沉前后各項指標(biāo)，并計算多糖保留率、蛋白質(zhì)清除率、固形物去除率，結(jié)果見表6。

表6 對照驗證實驗

由表6可知，在此醇沉條件下，多糖保留率51.07%、蛋白質(zhì)清除率89.69%、固形物去除率51.46%。結(jié)果表明多糖保留率很低，基本上多糖含量在此工藝中損失一半。

3 結(jié) 論

通過單因素和正交實驗優(yōu)化白術(shù)多糖提取液的最佳澄清工藝條件為藥液比=1∶15 g/mL，澄清劑加入量V(b)∶V(a)∶V(藥液)=10∶5∶100，水浴溫度50 ℃，水浴時間20 min。結(jié)果表明在此工藝條件下多糖保留率高、蛋白質(zhì)和固形物去除率較高，且工藝簡單、安全穩(wěn)定、成本低，優(yōu)于傳統(tǒng)的水提醇沉法，為白術(shù)多糖的進(jìn)一步純化和深入研究提供了實驗依據(jù)。

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