趙云山,吳培賽,2,張慧文,程向暉,石松利，*,劉全禮,周紅兵

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040;2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南懷化 418000)

蒙古扁桃藥材正丁醇提取物降血脂作用的量效關(guān)系及其化學(xué)成分的研究

趙云山1,吳培賽1,2,張慧文1,程向暉1,石松利1，*,劉全禮1,周紅兵1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040;2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南懷化 418000)

目的:探索蒙古扁桃正丁醇提取物降血脂作用的量效關(guān)系,研究其化學(xué)成分。方法:使用正丁醇提取蒙古扁桃種仁,得正丁醇提取物。大鼠按體重均衡隨機(jī)分組,分別為空白組和模型組,空白組給予普通飼料飼養(yǎng),模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立高脂模型。建模成功后,持續(xù)按前述方法飼養(yǎng),將大鼠分為空白組、模型對照組、陽性藥組(辛伐他汀)、蒙古扁桃藥材正丁醇提取物給藥組?？瞻捉M與模型對照組灌胃給予生理鹽水,實驗組以不同劑量的蒙古扁桃正丁醇提取物(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg)灌胃。給藥七周后測定大鼠血清中Total cholesterol(TC)、Triglyceride(TG)、High-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)、Low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C)的含量;使用色譜、波譜手段分離提純蒙古扁桃正丁醇提取物。結(jié)果:與高脂模型組相比,0.25、0.5、4.0 g/kg正丁醇提取物無顯著降血脂作用,1.0、2.0 g/kg正丁醇提取物組能顯著降低TC,LDL-C含量(p<0.05),且以2.0 g/kg的效果最好;從蒙古扁桃正丁醇提取物中提取出來的化合物為苦杏仁苷單體。結(jié)論:蒙古扁桃藥材正丁醇提取物起降血脂的劑量在1.0～2.0 g/kg之間,且以2.0 g/kg生藥量最好;苦杏仁苷為首次從蒙古扁桃種仁中分離出來。

蒙古扁桃,正丁醇提取物,降血脂,量效關(guān)系,化學(xué)成分

隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變,高脂血癥的發(fā)病率也在逐年提高。高脂血癥包括TC或TG 水平過高和(或)HDL-C水平過低[1],表現(xiàn)為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。高脂血癥已被證明是心腦血管疾病諸如高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、腦中風(fēng)等的獨立危險因素[2-4],它是一種慢性疾病,需要長期服藥[5]。市場上銷售的降血脂西藥作用雖然比較顯著,但對機(jī)體產(chǎn)生的副作用同樣較大[6]。與西藥相比,中草藥在治療疾病時具有的一個巨大優(yōu)勢就是將人和自然看作一個整體,把人體和疾病看作一個整體,而不是機(jī)械的把機(jī)體和疾病割裂開來。因此,開發(fā)中草藥降血脂新藥具有巨大的使用價值[7]。

蒙古扁桃,蒙名為烏蘭-布衣勒斯[8],其種仁作為傳統(tǒng)的中藥材,主治咽喉干燥、干咳及支氣管炎、陰虛便秘等證,也可用作鎮(zhèn)靜劑和止痛劑。目前國內(nèi)外對蒙古扁桃的研究大多集中在植物形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、地理分布等方面[9]。在藥理學(xué)方面,本課題組發(fā)現(xiàn)蒙古扁桃藥材新的藥理作用,即種仁水粗提液能降低高脂血癥大鼠的血脂水平[10];其種仁的正丁醇提取物具有降低高脂血癥大鼠血脂水平的作用[11]。但蒙古扁桃藥材正丁醇提取物的降血脂作用的量效關(guān)系、其化學(xué)成分的研究尚未見報道。本文在以往研究的基礎(chǔ)上采用高脂血癥大鼠模型,測定各實驗組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C,探索蒙古扁桃藥材正丁醇提取物降血脂作用的量效關(guān)系,研究蒙古扁桃藥材正丁醇提取物的化學(xué)成分,為深度利用蒙古扁桃資源、進(jìn)一步開發(fā)蒙古扁桃新的藥理作用及降血脂藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar雄性大鼠,SPF級,初體質(zhì)量(90± 20) g,由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證:SCXK(蒙)2002-0001。飼養(yǎng)條件:室溫(25±2) ℃,相對濕度55%±2%。

蒙古扁桃藥材 采自內(nèi)蒙古阿拉善雅布賴戈壁,經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院石松利教授鑒定為薔薇科植物蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)的干燥成熟種子;大小鼠維持飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司;蛋黃粉、膽固醇 鄭州龍晨食品添加劑有限公司,批號20150624;豬膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號:20150702;丙硫氧嘧啶片 上海朝暉藥業(yè)有限公司,批號:1402F09;辛伐他汀 山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司,批號:130508;TC試劑盒(批號:OSR6216)、TG試劑盒(批號:OSR61118E)、LDL-C試劑盒(批號:OSR6283)、HDL-C試劑盒(批號:OSR6287) 均購自美國貝克曼公司;重水(D2O)。

全自動脫帽離心機(jī) 長沙鑫奧儀器;Olympus AU640全自動生化分析儀 日本奧林巴斯公司;DZW-8-8型水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GZX-DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 山東濰坊醫(yī)療器械廠;超高效電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-DAD-ESI-MS) 安捷倫科技有限公司;核磁共振微成像譜儀 瑞士布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高脂飼料配方 將77.4%基礎(chǔ)飼料、10%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%豬膽鹽和0.1%丙硫氧嘧啶[11]稱量后按比例充分混勻,再緩慢加入融化的豬油(每kg高脂飼料含100 g豬油),邊加邊攪拌,使其充分混合,制備高脂飼料。

1.2.2 蒙古扁桃藥材正丁醇提取物的制備 取蒙古扁桃生藥研碎,置于索氏提取器中,用10倍體積的95%乙醇(v/v)水浴提取3次,每次2 h;再用10體積的50%乙醇(v/v)提取3次,每次2 h,得粗提液[11]。分別使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和水浴鍋濃縮粗提液至膏狀。將粗膏與等質(zhì)量的硅藻土攪拌均勻,按照極性大小的順序,先依次用石油醚、乙酸乙酯溶液將粗膏中極性較小的物質(zhì)提取出來,然后再使用正丁醇溶液提取出實驗所需要的部分,最后再用蒸餾水提取,濃縮干燥后得正丁醇提取物,并計算正丁醇提取物所占比重。

1.2.3 給藥劑量 在上述實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)置蒙古扁桃正丁醇提取物生藥量梯度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg,分別命名為A組,B組,C組,D組,E組。根據(jù)正丁醇提取物所占比重及給藥劑量配制溶液。陽性藥辛伐他汀根據(jù)說明書,換算為大鼠的給藥劑量,為1.02 mg/kg bw。4 ℃冰箱保存。正丁醇提取物溶液及陽性藥均按0.6 mL·100 g-1bw灌胃。

1.2.4 動物分組及處理 取符合健康標(biāo)準(zhǔn)的Wistar雄性大白鼠80只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,按照體重隨機(jī)分成8組,每組10只,即空白對照組,高脂模型組,陽性藥對照組,蒙古扁桃藥材正丁醇提取物處理組(A組,B組,C組,D組和E組)。實驗期間除空白對照組自由采食基礎(chǔ)飼料外,其余各組按照平均23～27 g/只的量喂食高脂飼料。各組大鼠自由飲水。造模5周后,禁食不禁水12 h后眼眶靜脈叢采血,測定TC、TG、HDL-C以及LDL-C。高脂模型建立成功后,空白對照組及高脂血模型組灌胃生理鹽水,陽性藥組灌胃辛伐他汀溶液,其余各組灌以相應(yīng)的蒙古扁桃藥材正丁醇提取物。給藥七周后,禁食不禁水12 h后眼眶靜脈叢采血,分離血清,測定TC、TG、HDL-C和LDL-C。

表1 高脂血癥大鼠模型造模結(jié)果Table 1 Blood lipid levels of rats after five weeks feeding of

注:Δ:與空白對照組相比,p<0.05;ΔΔ:與空白對照組相比,p<0.01。

表2 蒙古扁桃藥材正丁醇提取物對高脂血癥大鼠血脂的影響Table 2 Effects of n-BuOH extracts of Amygdalus Mongolica on blood lipid in

注:Δ:與空白對照組相比,p<0.05;ΔΔ:與空白對照組相比,p<0.01;#:與高脂模型組相比,p<0.05。

1.2.5 蒙古扁桃藥材正丁醇提取物的分離 將蒙古扁桃正丁醇提取物采用濕法上樣到D101大孔樹脂柱中,分別以10%、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫,采用薄層硅膠色譜檢測流份,展開劑為四氯化碳∶甲醇=4∶1,在254 nm紫外燈下檢識,將具有相同色譜特征的流份合并濃縮。將10%、30%梯度酒精流份采用濕法上樣到ODS柱,用甲醇溶液梯度洗脫,展開劑為乙酸乙酯∶甲酸∶水=20∶3∶1,在254 nm紫外燈下檢識。根據(jù)薄層檢識結(jié)果,將有相同色譜特征的流份合并,回收溶劑,得無色粉末狀化合物1。

1.2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.6.1 UPLC-DAD-ESI-MS 采用ESI負(fù)離子模式,碎片電壓50 V,毛細(xì)管電壓3500 V,霧化壓力45 psi,干燥氣體溫度350 ℃,質(zhì)譜離子范圍100～1500 m/z。色譜條件為:色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm;particle size,1.8 μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,流速為0.4 mL/min。洗脫梯度如下:0～3 min 10%～30% B,4～5 min 30%～100%B,5～6 min 100% B。

1.2.6.2 核磁共振分析 以D2O為溶劑,在500 MHZ的頻率下對分離出來的化合物進(jìn)行核磁共振波譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血癥大鼠模型造模結(jié)果

各組大鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)五周后,采血,測定其血脂指標(biāo),實驗結(jié)果見表1。

由表1可知,與空白對照組相比,高脂模型組、辛伐他汀處理組及蒙古扁桃藥材正丁醇提取物(A-E組)大鼠血清中的TC、LDL-C和HDL-C的含量均顯著升高(p<0.05),TG含量顯著降低(p<0.05),表明模型組大鼠存在血脂代謝紊亂,高脂血癥模型造模成功。

2.2 蒙古扁桃藥材正丁醇提取物對高脂血癥大鼠血脂的影響

由表2可知,與空白對照組相比,高脂模型組大鼠血清中TC和LDL-C水平顯著升高(p<0.05),說明高脂模型穩(wěn)定,造模成功。與高脂模型組相比,A組和B組LDL-C含量顯著降低(p<0.05)。C組和D組的TC、LDL-C含量均顯著降低(p<0.05)。實驗結(jié)果表明,1.0、2.0 g/kg正丁醇提取物具有降血脂作用,且以2.0 g/kg的效果最好。說明蒙古扁桃正丁醇提取物有降血脂作用的劑量范圍在1.0～2.0 g/kg之間。當(dāng)劑量達(dá)到4.0 g/kg時,已經(jīng)超過了其起效的范圍,因此無顯著降血脂作用。

2.3 液-質(zhì)聯(lián)用結(jié)果

圖1 化合物1的UPLC-DAD-ESI-MS圖譜Fig.1 UPLC-DAD-ESI-MS spectras of compound 1

化合物1的HPLC圖譜顯示在保留時間2.2 min處出峰。其質(zhì)譜顯示分子離子峰[M-H]-為m/z 456、[M+COOH]-為m/z 502、[M-C2H2]-為m/z 431,表明其相對分子質(zhì)量為457。其他主要峰有913為[M*2-H]-,提示該化合物為生物堿。

2.4 核磁共振結(jié)果

化合物1為白色無定型粉末;1H NMR(D2O,500 MHz)顯示有單取代苯環(huán)信號:S 7.43(2H,m,H-2,6),7.36(3H,m,H-3,4,5),一個連氧次甲基信號: δ5.89(1H,s,H-7)和兩分子葡萄糖信號:δ 4.65(lH,d,J=8.1 Hz,H-15),4.62(lH,d,J=7.5Hz,H-9)。13C NMR譜數(shù)據(jù)見表3。13C NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的苦杏仁苷(Amygdalin)一致[12],故化合物鑒定為苦杏仁苷(Amygdalin)。

圖2 苦杏仁苷Fig.2 Amygdalin

表3 化合物1的13 C NMR譜數(shù)據(jù)Table 3 13 C NMR data of compound 1

2.5 苦杏仁苷含量

合并含有相同成分的流份,回收溶劑,得固體結(jié)晶,稱重,算得苦杏仁苷在蒙古扁桃藥材正丁醇提取物中所占質(zhì)量比重為47.72%。

3 結(jié)論與討論

本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)法成功建立起穩(wěn)定的高膽固醇型高脂血癥大鼠模型,這與姬鳳彩[13]等人研究高脂飼料喂養(yǎng)法建立高脂血癥大鼠模型適合應(yīng)用于單純性高膽固醇型高脂血癥的研究,不適合用于混合型高脂血癥、高甘油三酯和低高密度脂蛋白血癥的結(jié)果相一致。

量效關(guān)系是指在一定的劑量范圍內(nèi),藥物效應(yīng)隨著藥物劑量的變化而呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的變化[14]。合適的用藥劑量是保證藥物安全有效的關(guān)鍵問題,選擇藥物的最佳劑量,這是臨床用藥的關(guān)鍵問題[15]。此部分采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立高脂血癥大鼠模型,設(shè)置蒙古扁桃正丁醇提取物生藥量梯度為0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 g/kg,探索蒙古扁桃正丁醇提取物降血脂作用的有效作用范圍和最佳劑量。實驗結(jié)果表明,隨著蒙古扁桃正丁醇提取物劑量的增加,其對高脂血癥大鼠血脂水平的作用大體呈先升高后降低的趨勢,在2.0 g/kg生藥量下其降血脂作用最強(qiáng)。當(dāng)生藥量達(dá)到4.0 g/kg時,其降脂作用又有所降低。因此確定蒙古扁桃正丁醇提取物降血脂的有效劑量為1.0～2.0 g/kg,且2.0 g/kg為其降低高脂血癥大鼠血脂水平的最佳劑量。

本論文采用色譜、波譜手段對蒙古扁桃藥材正丁醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分的研究,首次從中得到苦杏仁苷單體化合物。苦杏仁苷具有多種藥理作用,例如抗腎間質(zhì)纖維化、抗肺纖維化、抗高氧誘導(dǎo)肺損傷、免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎以及抗?jié)僛16],并且能夠降低動脈粥樣硬化小鼠的TC、TG和LDL-C[17]。課題組后續(xù)將對種仁里其它化合物進(jìn)一步分離鑒定,并對得到的苦杏仁苷及其它化合物進(jìn)行藥效學(xué)篩選、整體動物實驗驗證、機(jī)制作用研究,以期將其開發(fā)成為安全、低毒、有效的治療藥物。

[1]范麗麗,龔一萍.辨證治療高脂血癥的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(11):2333-2335.

[2]Basciano H,FEDERICOL L. Fructose,insulin resistance and metabolic dyslipidemia[J].Nutrition Metab,2005,2(1):1-14.

[3]Maria A.The reduction of dietary sucrose improves dyslipidemia,adiposity and insulin secretion in an insulin resistant rat model[J].Cnin Trad it Herb Drugs,2001,32(9):8522-8551.

[4]馮利民,李立鳳,杜武勛,等.高脂血癥基本病機(jī)與證型規(guī)律研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(12):3101-3103.

[5]袁娟,衛(wèi)娜,徐勇,等.白豆中提取的α-淀粉酶抑制劑調(diào)節(jié)高脂血癥的研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(23):127-129,135.

[6]王飛.辛伐他汀的臨床不良反應(yīng)研究[J].中國現(xiàn)代藥用,2009,3(1):107-108.

[7]周紅軍,郭巍.中藥治療高血脂癥的臨床研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(20):2592-2593.

[8]馬毓泉.內(nèi)蒙古植物志(第三卷)[M].呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社,1989:519-522.

[9]杜巧珍,紅雨,包賀喜圖.珍稀瀕危植物蒙古扁桃研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)漢文版,2010,39(3):309-313.

[10]白迎春,石松利,鈕樹芳,等.蒙古扁桃藥材對大鼠高脂血癥的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(10):2406-2407.

[11]吳培賽,石松利,周紅兵,等.蒙古扁桃藥材不同提取物對高脂血癥大鼠血脂和肝功能的影響[J].中國實驗方劑學(xué)志,2015,21(21):113-117.

[12]陳曉燕.桃仁、桑葉化學(xué)成分及生物活性研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2014.

[13]姬鳳彩,姚剛,李琳琳,等.對大鼠高脂血癥模型分型的討論[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,30(11):1297-1298.

[14]段金廒,范欣生,宿樹蘭,等.中藥及方劑量效關(guān)系的研究進(jìn)展與思考[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,25(4):241-245.

[15]謝晚晴,連鳳梅,姬航宇,等.中藥量效關(guān)系研究進(jìn)展[J].中醫(yī)雜志,2011,52(19):1696-1699.

[16]王彬輝,章文紅,張曉芬,等.苦杏仁苷提取工藝及藥理作用研究新進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,32(2):381-384.

[17]DENG J,LI C,WANG H,et al. Amygdalin mediates relieved atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice through the induction of regulatory T cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,411(3):523-529.

Studies on dose-effect relationship of n-butanol extracts ofAmygdalusmongolicaon reducing blood lipid and its chemical constituents

ZHAO Yun-shan1,WU Pei-sai1,2,ZHANG Hui-wen1,CHENG Xiang-hui1,SHI Song-li1，*,LIU Quan-li1,ZHOU Hong-bing1

(1.Baotou Medical College,Baotou,014040,China;2.Hunan University of Medicine,Huaihua,418000,China)

Objective:To explore the dose-effect relationship of n-butanol extracts ofAmygdalusmongolicaon reducing blood lipid and study the chemical constituents of the n-butanol extracts ofAmygdalusmongolica. Methods:Kernels ofAmygdalusMongolicawas extracted by n-butanol to get the n-butanol extracts. Wistar rats were randomly assigned into two weight balanced groups:the blank control group and the model group. The blank control group was fed with general diets,the model group was fed with high fat diets to build hyperlipemia model. After the models were successfully built,keeping in accordance with the above feeding methods,Wistar rats were divided into four treatment groups:the blank control group,the model group,the positive drug group(Simvastatin)and the different doses of n-butanol extracts treatment group. The blank control and the model group were treated with physiological saline by intragastric administration,the different doses of n-butanol extracts treatment group were treated with 0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 g/kg n-butanol extracts by intragastric administration respectively. After seven weeks of administration,the contents of total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)and low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C)were determined. N-butanol extracts ofAmygdalusmongolicawere separated and purified by chromatographic and spectroscopic methods. Results:Comparing to hyperlipemia model,0.25,0.5 g/kg and 4.0 g/kg n-butanol extracts didn’t show significant effect of reducing blood lipid,while 1.0 g/kg and 2.0 g/kg n-butanol extracts could significantly reduce the contents of TC and LDL-C(p<0.05),and the effect of 2.0 g/kg n-butanol extracts was the best;amygdalin was isolated from n-butanol extracts ofAmygdalusmongolica. Conclusion:The dose of n-BuOH extracts being effective ranged from 1.0 g/kg to 2.0 g/kg,and the dose of 2.0 g/kg n-BuOH extracts showed best effect. Amygdalin was isolated from kernels ofAmygdalusmongolicafor the first time.

AmygdalusMongolica;n-BuOH extracts;declining blood lipids level;dose-effect relationship;chemical compouds

2016-08-22

趙云山(1965-)，男，碩士，副教授，主要從事中蒙藥化學(xué)成分研究，E-mail:wpsdabaicai@163.com。

*通訊作者:石松利(1981-)，女，博士，教授，主要從事植物化學(xué)和中蒙藥化學(xué)成分及資源開發(fā)利用研究，E-mail:shisongli122@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目(81102760)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計劃項目(NJYT-15-B01)；包頭醫(yī)學(xué)院博士基金項目(BSJJ201616)資助。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)03-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.059