夏乾竣,王月皎,王 飛,李 迅

(南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,江蘇南京 210037)

田口設(shè)計(jì)優(yōu)化解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基

夏乾竣,王月皎,王 飛,李 迅*

(南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,江蘇南京 210037)

本研究以粗甘油為碳源通過田口設(shè)計(jì)對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油脂的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)得到對(duì)結(jié)果影響最顯著的因素,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Minitab 17設(shè)計(jì)田口式正交實(shí)驗(yàn),對(duì)實(shí)驗(yàn)中各因素水平的均值和信噪比進(jìn)行分析。結(jié)果表明培養(yǎng)基中的C/N和MgSO4·7H2O的濃度對(duì)油脂產(chǎn)量有極顯著影響,CaCl2的濃度有顯著影響。最佳培養(yǎng)基組成為C/N為100∶1(粗甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L。使用最佳培養(yǎng)基配方在28 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)4 d,油脂產(chǎn)量達(dá)到1.859 g/L,與田口設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)結(jié)果1.782 g/L接近,相對(duì)于未優(yōu)化時(shí)油脂產(chǎn)量提高了48.5%。

解脂耶羅維亞酵母,微生物油脂,發(fā)酵條件優(yōu)化,Minitab,田口設(shè)計(jì)

解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)作為產(chǎn)油酵母能利用糖、甘油、地溝油等多種碳源來生產(chǎn)單細(xì)胞油脂[1-4]。油脂中的脂肪酸成分主要為棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸,其中約一半為油酸,少部分為亞油酸[5]。油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸在人和動(dòng)物的新陳代謝中起著重要的作用,具有降低生物體脂肪、抑制腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生理功能[6]。人體無法合成亞油酸等不飽和脂肪酸來保證機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn),要從食物中攝入[7]。解脂耶羅維亞酵母是為數(shù)不多的通過美國(guó)FDA和GRAS認(rèn)證的真菌,可以應(yīng)用到食品和醫(yī)藥生產(chǎn)等眾多領(lǐng)域[8-9],因此解脂耶羅維亞酵母為原料生產(chǎn)保健品或者動(dòng)物飼料具有極高的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外主要以葡萄糖作為碳源進(jìn)行解脂耶羅維亞酵母的發(fā)酵產(chǎn)油,對(duì)通過代謝工程改造后的菌株油脂產(chǎn)量最高能達(dá)到15 g/L[10-11]。本研究是以生物柴油的副產(chǎn)物甘油作為酵母生長(zhǎng)的碳源,優(yōu)化發(fā)酵條件生產(chǎn)單細(xì)胞油脂。

穩(wěn)健參數(shù)設(shè)計(jì)(Robust Parameter Design)也稱田口設(shè)計(jì),是由于日本田口玄一(Genichi Taguchi)博士在參數(shù)設(shè)計(jì)方面的杰出貢獻(xiàn),他引進(jìn)了S/N(信噪比)的概念,并以此作為評(píng)價(jià)參數(shù)組合優(yōu)劣的一種測(cè)度[12]。其基本思想是將穩(wěn)定性設(shè)計(jì)到產(chǎn)品的制造過程中去,以信噪比作為穩(wěn)定性的指標(biāo),從而找到最優(yōu)的設(shè)計(jì)方案[13-14]。目前,Minitab和JMP是業(yè)界最主流的兩款六西格瑪統(tǒng)計(jì)分析軟件,均能實(shí)現(xiàn)田口設(shè)計(jì),其中Minitab軟件是世界上應(yīng)用最廣的統(tǒng)計(jì)軟件之一,其功能強(qiáng)大且操作簡(jiǎn)單。本研究使用Minitab軟件設(shè)計(jì)田口式正交實(shí)驗(yàn),以解脂耶羅維亞酵母為發(fā)酵菌株,以廉價(jià)的甘油為碳源優(yōu)化發(fā)酵條件,實(shí)現(xiàn)其胞內(nèi)油脂的高效生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型Yarrowialipolytica2.2087 購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;酵母提取物,蛋白胨 購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；粗甘油 來自于常州強(qiáng)林生物質(zhì)能源材料有限公司;甘油含量為89.7%,灰分為0.3%,其余為水。地溝油 來自于常州悅達(dá)卡特新能源有限公司主要成分為飽和甘油三酯和飽和游離脂肪酸。其他生化試劑及藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

志誠(chéng):RS-232恒溫?fù)u床 日本Hirayama:HVA-85滅菌鍋 南京稼竣生物科技有限公司:A502200可視氮吹儀 南京恒裕儀器:生化培養(yǎng)箱SP-300B 瑞士梅特勒-托利多:AL104電子分析天平 蘇凈集團(tuán)安泰公司:VS-1300L-U超凈臺(tái) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司:DHG-9123A恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 將菌種粉末溶解在5 mL YPG(甘油2 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母提取物1 g/L,121 ℃滅菌20 min,固體培養(yǎng)基在YPG的基礎(chǔ)上加2%的瓊脂)培養(yǎng)基中,28 ℃ 180 r/min活化12 h,12 h后取活化后的菌液再次活化,以10%甘油保菌。保藏菌在 YPG固體培養(yǎng)基上劃線,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱48 h。從固體培養(yǎng)基上取少許菌體,接種于5 mL YPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。再以1%接種量接種于50 mL YPG培養(yǎng)基中,28 ℃ 搖床180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h作為種子液。按10%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(粗甘油50 g/L,(NH4)2SO41.08 g/L,KH2PO44 g/L,MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,121 ℃滅菌20 min)中,28 ℃ 180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

1.2.2 生物量的測(cè)定 將發(fā)酵液于10000 r/min離心10 min收集菌體,去離子水洗滌菌體兩次。去掉上清,菌體在85 ℃烘箱烘干至恒重,比較烘干前后兩次離心管的質(zhì)量差得到菌體的干重。

1.2.3 油脂的提取 每克干菌加入4 mol/L HCl 6 mL,靜置20 min后,煮沸30 min,立即放置于-20 ℃迅速冷卻,以破壞細(xì)胞壁。加入兩倍體積的氯仿/甲醇混合溶液(體積比1∶1),充分震蕩萃取,10000 r/min離心5 min,收集氯仿層,重復(fù)萃取一次。氯仿萃取液中加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的NaCl,以除去一些游離的脂肪酸。10000 r/min離心5 min,收集氯仿層,使用氮吹快速除去氯仿得到油脂,比較前后兩次離心管的質(zhì)量得到油重[15],以油脂的產(chǎn)量作為最終的表征數(shù)據(jù)。產(chǎn)油率計(jì)算公式為:產(chǎn)油率=產(chǎn)油量/菌體干重

1.2.4 碳源的選擇 解脂耶羅維亞酵母能夠廣泛利用碳源進(jìn)行自身的生長(zhǎng)如:糖類、甘油、地溝油等。不同的碳源在解脂耶羅維亞酵母體內(nèi)參與的代謝過程各不相同,解脂耶羅維亞酵母對(duì)不同碳源的利用能力也不同。分別選取葡萄糖、純甘油、粗甘油、地溝油作為碳源,研究不同碳源對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油能力的影響。培養(yǎng)條件為碳源50 g/L,酵母提取物2 g/L,28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)4 d,找出解脂耶羅維亞酵母培養(yǎng)的最佳碳源。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) C/N是影響菌株油脂合成的重要因素。以甘油為碳源和(NH4)2SO4為氮源,保持碳源甘油的量為50 g/L,調(diào)整C/N分別為25、50、75、100、125,(NH4)2SO4的濃度分別為4.3、2.15、1.43、1.08、0.86 g/L其它培養(yǎng)條件不變,分別測(cè)定最終的油脂產(chǎn)量。同時(shí)KH2PO4、CaCl2和MgSO4·7H2O是對(duì)細(xì)胞油脂影響最大的幾種無機(jī)鹽。在細(xì)胞分裂增殖過程中磷起著至關(guān)重要的作用,它是核酸、磷脂、ATP的重要組成,生物體在缺少磷時(shí)其自身的部分機(jī)能將無法正常運(yùn)行,磷的含量直接關(guān)系到細(xì)胞的生長(zhǎng)。鉀離子和鎂離子是許多酶的激活劑是生物體內(nèi)含量最高的幾種離子,維持著細(xì)胞體的正常生物活動(dòng)。鈣離子能激活α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶,使代謝向有利于油脂合成代謝的方向進(jìn)行[16-17]。采用單因素實(shí)驗(yàn),考察各個(gè)因素變量對(duì)解脂耶羅維亞酵母油脂產(chǎn)量的影響。

1.2.6 田口設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)這四個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析,利用Minitab 17里的DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)田口式正交實(shí)驗(yàn)。選用L16(44)正交設(shè)計(jì)表配制培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以產(chǎn)油量為響應(yīng)值,正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5軟件作圖,利用Minitab 17軟件田口式正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油性能的影響

結(jié)果如圖1所示,選取葡萄糖、純甘油、粗甘油、地溝油為碳源發(fā)酵,雖然以甘油為碳源的油脂的產(chǎn)率和產(chǎn)量不是最高,低于以葡萄糖和地溝油作為碳源的油脂產(chǎn)率和產(chǎn)量。但葡萄糖成本較高,地溝油成分復(fù)雜且不穩(wěn)定,而甘油作為生物柴油的副產(chǎn)物,產(chǎn)量大且利用價(jià)值低,成份較穩(wěn)定,所以本實(shí)驗(yàn)采用來源廣泛且價(jià)格低廉的甘油作為解脂耶羅維亞酵母發(fā)酵的碳源。以粗甘油為碳源,油脂產(chǎn)率為29.1%,油脂產(chǎn)量為1.252 g/L。

圖1 碳源對(duì)產(chǎn)油的影響Fig.1 Effect of carbon source on oil production

2.2 不同碳氮比對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油性能的影響

酵母的生長(zhǎng)一般分為菌體的增殖期和油脂的累積期[18]。當(dāng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)主要來進(jìn)行菌體的增殖,當(dāng)?shù)聪拇M且碳源充足時(shí),則進(jìn)入油脂的累積期[19]。

由圖2可知,當(dāng)C/N過低時(shí),培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分充足,菌體主要進(jìn)行自身的增殖,油脂累積期時(shí)間較短,油脂含量較低,菌體重量較大。隨著碳氮比的增加,培養(yǎng)基內(nèi)氮源逐漸減少,菌體的重量下降,當(dāng)?shù)聪拇M菌體進(jìn)入油脂累積期,產(chǎn)油量上升。當(dāng)C/N為50時(shí),終得到的油脂含量最高,達(dá)1.282 g/L。

圖2 碳氮比對(duì)產(chǎn)油的影響Fig.2 Effect of C/N Ratio on oil production

2.3 無機(jī)鹽對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油性能的影響

由圖3所示,當(dāng)培養(yǎng)基中加入CaCl2、MgSO4·7H2O和KH2PO4的濃度分別為0.1、3、4 g/L時(shí),酵母的產(chǎn)油量有顯著的上升。其中CaCl2的效果最佳,加入0.1 g/L的CaCl2,酵母的產(chǎn)油量達(dá)1.504 g/L,比未加CaCl2的酵母產(chǎn)油量上升28.1%。這可能是因?yàn)镃a2+在解脂耶羅維亞酵母的油脂累積過程中,對(duì)關(guān)鍵酶的激活作用比Mg2+和K+更強(qiáng)。并且鈣離子還可以促使細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP 的合成,為微生物的生長(zhǎng)提供能量,從而促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和油脂累積[20]。

圖3 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)油的影響Fig.3 Effect of inorganic salts on oil production

2.4 田口式正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表見表2。田口設(shè)計(jì)中是以信噪比來作為質(zhì)量特性的衡量指標(biāo)的,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同將信噪比分為望目特性、望大特性和望小特性。望目特性是指期望目標(biāo)值圍繞某點(diǎn)波動(dòng),望大是希望質(zhì)量特性值越大越好,望小是希望質(zhì)量特性值越小越好[20]。本實(shí)驗(yàn)是提高酵母的產(chǎn)油量,選取望大特性。利用Minitab 17對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到表3和表4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

對(duì)表3的均值響應(yīng)表和表4的信噪比響應(yīng)表進(jìn)行分析,可知各因素對(duì)產(chǎn)油量影響的程度為A(C/N)>B(MgSO4·7H2O)>C(CaCl2)>D(KH2PO4)。分析表5均方差結(jié)果顯示,C/N和MgSO4·7H2O對(duì)解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)油量的影響極顯著,CaCl2影響顯著,而KH2PO4影響不顯著。綜上可以得出在培養(yǎng)基組分為A3B3C2D4時(shí)油脂的產(chǎn)量最大,同時(shí)信噪比最大,結(jié)果具有最強(qiáng)的穩(wěn)健性。即培養(yǎng)基的C/N為100∶1(甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L時(shí),該株解脂耶羅維亞酵母油脂產(chǎn)量最大。以此優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表3 均值響應(yīng)表Table 3 Mean response table

表4 信噪比響應(yīng)表Table 4 Signal to noise ratio response table

表5 均值方差分析表Table 5 Analysis of variance of mean value

注：*代表影響顯著,**代表影響極其顯著。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

田口設(shè)計(jì)的一大優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行預(yù)測(cè),由于正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件在正交表中并不存在,故用Minitab 17中的DOE-田口-預(yù)測(cè)田口結(jié)果對(duì)A3B3C2D4進(jìn)行預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果為油脂產(chǎn)量1.782 g/L。按照優(yōu)化好的培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn),油脂產(chǎn)量為1.859 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期值較為接近,且比優(yōu)化前的油脂產(chǎn)量提高了48.5%,說明此優(yōu)化方案達(dá)到了預(yù)期的優(yōu)化效果。

3 結(jié)論與討論

采用野生型Y.lipolytica2.2087發(fā)酵生產(chǎn)油脂,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定對(duì)油脂產(chǎn)量影響較大的因素。按照田口法設(shè)計(jì)了L16(44)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分析實(shí)驗(yàn)中各因素水平的均值情況和信噪比情況確定了對(duì)油脂產(chǎn)量影響最大的因素為C/N,MgSO4·7H2O濃度CaCl2濃度KH2PO4濃度。最佳的培養(yǎng)基組合為:C/N為100∶1(甘油50 g/L,硫酸銨1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L。28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)4 d后油脂產(chǎn)量達(dá)到1.859 g/L,與田口設(shè)計(jì)預(yù)期值接近,且比優(yōu)化前的油脂產(chǎn)量提高了48.5%,此時(shí)胞內(nèi)油脂含量為35.4%。據(jù)趙春海等報(bào)道Y.lipolytica分別以葡萄糖、果糖、蔗糖及菊粉等糖類物質(zhì)為碳源,硫酸銨和酵母提取物為氮源,細(xì)胞體內(nèi)的油脂含量約為30%,產(chǎn)量約為2 g/L[21]。本研究中以粗甘油為原料發(fā)酵解脂耶羅維亞酵母,油脂產(chǎn)量為1.859 g/L。原料甘油較糖類更為便宜,且以硫酸銨作為唯一氮源,這表明以甘油為碳源生產(chǎn)油脂同樣具有明顯優(yōu)勢(shì)。

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Establishment of optimum media for lipid production inYarrowialipolyticaby Taguchi method

XIA Qian-jun,WANG Yue-jiao,WANG Fei,LI Xun*

(Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

Taguchi orthogonal experimental design(TOED)was used to optimize the fermentation media of lipid production byY.lipolyticawith crude glycerol as carbon source in this study. Based on single factor test,TOED was established by Minitab 17. Then the means and SNRs(Signal to noise ratio)of each factor were analyzed and the results showed that C/N and the concentration of MgSO4·7H2O in the medium had a substantial significant impact on lipid production,the CaCl2concentration had a significant influence on lipid production. The optimal medium composition was C/N 100∶1(crude glycerol 50 g/L,ammonium sulfate 1.08 g/L),MgSO4·7H2O 3 g/L,CaCl20.2 g/L,KH2PO44 g/L. The fermentation broth with optimal media were incubated at 28 ℃ and 180 r/min for 4 days,the lipid yield reached 1.859 g/L and the predicted lipid yield of fitted model was 1.782 g/L. The oil yield increased by 48.5% compared with the orginal.

Yarrowialipolytica;microbial lipids;culture optimization;minitab;Taguchi design

2016-08-04

夏乾竣(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)單細(xì)胞油脂，E-mail：jsxqj1991@163.com。

*通訊作者:李迅(1975-)，女，博士，教授，研究方向：生物質(zhì)能源與化學(xué)品，E-mail：xunlee@njfu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270612);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015C22)。

TS201.2

B

:1002-0306(2017)03-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.030