梁金鐘,王翼雪,梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

植物乳桿菌富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

梁金鐘,王翼雪,梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

為提高植物乳桿菌(LactobacillusplantarumLb-30)的硒含量,滿足人們對于微量元素硒的日常膳食需求,以改良MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行富硒培養(yǎng),先確定最適亞硒酸鈉濃度,研究不同發(fā)酵時間、加硒時間、初始pH、接種量對菌體硒含量的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上采用Box-behnken設(shè)計對富硒培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最優(yōu)富硒培養(yǎng)條件組合方案為:亞硒酸鈉濃度5.0 μg/mL、加硒時間7.6 h、初始pH5.5、接種量 3.0%、培養(yǎng)時間36.0 h。優(yōu)化后,植物乳桿菌LB-30硒含量高達(dá)839.635 μg/g,比優(yōu)化前655.95 μg/g提高了1.28倍。結(jié)論:將為富硒植物乳桿菌的生產(chǎn)開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

植物乳桿菌,富硒含量,培養(yǎng)條件優(yōu)化

硒是人體所必需的14種微量元素之一,具有參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防癌癥、抑制病原菌等重要的生理學(xué)功能[1]。硒也是哺乳動物體內(nèi)許多酶活性中心的必需組分,如谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、脫碘酶(ID)等,具有保護(hù)細(xì)胞免受過度氧化損傷的作用。

研究顯示,谷物、蔬菜水果中的硒含量較低,不能滿足人們對于硒55 μg/d(推薦膳食攝入量)的日常飲食需求[2]。而常見的無機(jī)硒亞硒酸鈉又具有較強(qiáng)的毒副作用。因此,以微生物為載體通過菌體的吸收代謝過程,將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)有機(jī)硒的方法已受到國內(nèi)外相關(guān)專家的廣泛關(guān)注[3]。

乳酸菌作為有機(jī)硒的新型來源,因其益生菌良好的保健功能及可靠的安全性已被廣大消費(fèi)者所認(rèn)可,其生物學(xué)效應(yīng)和潛在開發(fā)應(yīng)用前景非常廣闊[4]。本文以誘變后的植物乳桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行富硒能力實驗,首先介紹了測定菌體富硒量的方法,后通過單因素實驗及響應(yīng)曲面分析法確定了植物乳桿菌的最佳富硒培養(yǎng)條件,為今后乳酸菌富硒的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LRH-生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;H1650-W臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;HYP-340智能消化爐 上海纖檢儀器有限公司;723N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌生長曲線測定 將活化后的菌株Lb-30按2%接種量接種于硒(IV)濃度為10 μg/mL的改良MRS培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng),采用比濁法,每隔3 h測定培養(yǎng)液OD600直至36 h,同時以未添加底物亞硒酸鈉培養(yǎng)基作為對照組,繪制生長曲線,考察底物硒(IV)添加前后植物乳桿菌的生長規(guī)律[5]。

1.2.2 硒含量的測定

1.2.2.1 紫外全波長掃描 為證明硒(IV)與2,3-二氨基萘反應(yīng)生成的絡(luò)合物在特定波長下有吸收峰,并且其吸光度與硒含量有較好的相關(guān)性,以水為基線,對Se-DAN絡(luò)合物進(jìn)行紫外全波長掃描(350～600 nm)。為了提高測定體系的溶解性和靈敏度,我們向反應(yīng)體系中添加陰離子表面活性劑SDS,再進(jìn)行全波長掃描,觀察吸收峰的狀態(tài)[6]。

1.2.2.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 分取10 μg/mL的Na2SeO3標(biāo)準(zhǔn)工作液0、1、2、3、4、5 mL于10 mL比色管中,依次加入1 mL 0.1 mol/L的EDTA和0.05 mol/L的H2C2O4混合溶液(1∶1),混勻后加入0.4 mL 0.1%的DAN,沸水浴5 min,待冷卻后加入2.5 mL 0.1 mol/L的SDS,蒸餾水定容,于379.3 nm測定吸光度A并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7-8]。

1.2.2.3 富硒培養(yǎng) 植物乳桿菌屬兼性厭氧微生物,配制含硒(IV)質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的改良MRS培養(yǎng)液,以2%接種量接種后于37 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)36 h。

1.2.2.4 富硒菌體培養(yǎng)物制備 將發(fā)酵液以5000 r/min離心8 min,傾去上清,再加入磷酸鹽緩沖液(pH7.4)反復(fù)洗滌3次,洗去殘留于細(xì)胞表面的培養(yǎng)基成分。最后7000 r/min離心10 min獲得最終菌體培養(yǎng)物,50 ℃恒溫烘干至恒重備用[9]。

1.2.2.5 富硒菌粉的濕法消化 稱取0.1 g干菌體樣品于消化管中,加入混合酸消化液(HNO3-HClO34∶1)10 mL,放置過夜。后于消化爐300 ℃消化,待消化液呈無色或淡黃色時,第一階段完成;再加入5 mL 0.1 mol/L的HCl,待消化液剩余體積為1 mL時,達(dá)到終點(diǎn)[10]。

1.2.2.6 菌體總硒含量的測定 待消化液冷卻后稀釋10倍取5 mL樣液,按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定菌體富硒含量,同時做空白對照。富硒量計算方法如下:

式中:A為菌體細(xì)胞內(nèi)硒含量;B為菌體細(xì)胞干質(zhì)量。

1.3 底物濃度對富硒含量的影響

配制含硒(Ⅳ)質(zhì)量濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL(發(fā)酵液)的培養(yǎng)基,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h,利用1.2.2.2所述方法測定菌體富硒含量,確定最適加硒濃度[11]。

1.4 植物乳桿菌富硒培養(yǎng)條件單因素實驗

1.4.1 發(fā)酵時間對植物乳桿菌富硒量的影響 以改良MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在最適底物濃度條件進(jìn)行富硒培養(yǎng),分別調(diào)節(jié)發(fā)酵時間為24、30、36、42、48、54、60 h。按照2%接種量接種后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。利用1.2.2.2所述方法測定富硒含量,確定最佳發(fā)酵時間。

1.4.2 加硒時間對植物乳桿菌富硒量的影響 選取植物乳桿菌培養(yǎng)初期、對數(shù)初期、對數(shù)中期、對數(shù)末期作為亞硒酸鈉添加時間,按照2%接種量接種后37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h,考察在菌體不同生長時期加硒對其富硒量的影響[12]。利用1.2.2.2所述方法測定富硒含量,確定最佳加硒時間。

1.4.3 初始pH對植物乳桿菌富硒量的影響 以改良MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以最適底物濃度進(jìn)行富硒培養(yǎng),調(diào)節(jié)培養(yǎng)液初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,按照2%接種量接種后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h,考察不同初始pH對富硒含量的影響以及乳酸菌在生長過程中產(chǎn)酸對富硒積累的影響[13]。利用1.2.2.2所述方法測定菌體富硒含量,確定最佳初始pH。

1.4.4 接種量對植物乳桿菌富硒量的影響 分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富硒培養(yǎng),37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h,利用1.2.2.2所述方法測定菌體富硒含量,確定最佳接種量。

1.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化植物乳桿菌富硒培養(yǎng)條件

綜合單因素實驗結(jié)果,利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計,并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析,得到植物乳桿菌最佳富硒培養(yǎng)方案[14]。實驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Level and code of variables chosefor response surface experiment

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中每個處理重復(fù)3次,采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計,并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析,應(yīng)用Excel 2013軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌生長曲線繪制

通過對植物乳桿菌Lb-30生長曲線的繪制,確定其在改良MRS培養(yǎng)基及添加底物亞硒酸鈉培養(yǎng)液中的不同生長時期及生長規(guī)律。

表2 不同亞硒酸鈉濃度對植物乳桿菌富硒含量的影響Table 2 Effect of Na2SeO3concentration on enriched amount of Lb-30

注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖1 不同條件下植物乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curves of Lactobacillus plantarum in different cultural conditions

由圖1可知,0～3 h為菌體生長遲緩期,3 h后菌體進(jìn)入對數(shù)期;通過比較可知,加底物硒的培養(yǎng)液對菌體穩(wěn)定期生長起到延遲作用,進(jìn)入穩(wěn)定期的時間為12 h,而未加硒的改良MRS菌體進(jìn)入穩(wěn)定期的時間為9 h。說明高濃度亞硒酸鈉(10 μg/mL)會對菌體生長起到抑制延遲作用。因此,應(yīng)首先確定最適加硒濃度進(jìn)行富硒培養(yǎng)。

2.2 菌體富硒含量的測定

2.2.1 紫外全波長掃描驗證圖譜 以水為基線,分別對Se-DAN絡(luò)合物及添加了SDS的絡(luò)合物混合體系進(jìn)行紫外全波長掃描(350～600 nm),吸收光譜如圖2所示。

圖2 Se-DAN絡(luò)合物及添加SDS對照紫外掃描圖譜Fig.2 The absorption spectra for Se-DAN complex and addition of SDS

在掃描波長為379.3 nm,Se-DAN絡(luò)合物有最大吸收峰,而SDS的添加并不影響絡(luò)合物吸收峰的位置,只是改變了吸收峰高度。因此,我們選取379.3 nm為富硒含量測定的最佳工作波長。并在反應(yīng)體系中添加SDS,以其膠束增溶作用替代有機(jī)溶劑耗時的萃取過程。

2.2.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)工作液體積為橫坐標(biāo)(x),Se-DAN絡(luò)合物在379.3 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)(y)繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示。

圖3 富硒量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Selenium enrichment standard curve

通過統(tǒng)計分析得回歸方程y=0.2159x+0.0571,相關(guān)系數(shù)R2=0.9936。由此證明硒含量在0～2000 μg/g范圍內(nèi)與吸光值具有較好的相關(guān)性[15]。

2.3 底物濃度對植物乳桿菌富硒量的影響

不同亞硒酸鈉濃度條件下,植物乳桿菌的富硒能力不同,其菌體產(chǎn)量、總硒含量及硒轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的變化而有所不同,如表2所示:

由表2可知,菌體的富硒量隨底物濃度的升高而增加,當(dāng)Se(IV)濃度達(dá)到5 μg/mL時,菌體富硒量最大,而繼續(xù)增加Se(IV)濃度會抑制菌體生長,其富硒能力隨之下降。因此,我們選取Se(IV)濃度為5 μg/mL的培養(yǎng)液進(jìn)行單因素富硒實驗,優(yōu)化前菌體富硒含量為655.95 μg/g,硒轉(zhuǎn)化率為34.91%。另外,如表所示,植物乳桿菌菌體產(chǎn)量、總硒含量及硒轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān),因此,在培養(yǎng)條件優(yōu)化時,選取總硒含量作為考察植物乳桿菌富硒能力的指標(biāo)。

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵時間對植物乳桿菌富硒量的影響 由于底物亞硒酸鈉對菌體生長及代謝的延緩作用,考察不同發(fā)酵時間對其富硒量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時間對植物乳桿菌富硒量的影響Fig.4 Effect of culture time on enriched amount of Lb-30

如圖4所示,細(xì)胞內(nèi)富硒含量隨培養(yǎng)時間的增加而不斷增大,當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到36 h時,其富硒含量最大為665.739 μg/g,此時菌體生長處于穩(wěn)定期末期,富硒含量也趨于穩(wěn)定,當(dāng)菌體到達(dá)衰亡期,由于細(xì)胞的裂解作用,細(xì)胞內(nèi)溶物流出,微生物菌體富集的硒含量呈現(xiàn)下降趨勢,因此,我們選取36 h為最佳富硒發(fā)酵時間。

2.4.2 加硒時間對植物乳桿菌富硒量的影響 通過對植物乳桿菌Lb-30各生長階段的確定,考察其不同生長階段添加亞硒酸鈉對菌體富硒含量的影響結(jié)果見圖5。

圖5 加硒時間對植物乳桿菌富硒量的影響Fig.5 Effect of the optimum time to add Se on enriched amount of Lb-30

如圖5所示,由于對數(shù)期微生物代謝旺盛酶系活躍,對硒的轉(zhuǎn)化利用率也會相應(yīng)的提高,在植物乳桿菌的對數(shù)中期即8 h時添加亞硒酸鈉進(jìn)行富硒培養(yǎng),得到的菌體富硒含量最高。因此,我們選取8 h為添加底物亞硒酸鈉的最適時間,富硒量高達(dá)786.035 μg/g。

2.4.3 初始pH對植物乳桿菌富硒量的影響 培養(yǎng)環(huán)境的pH對菌體的生長起到關(guān)鍵性的作用,而乳酸菌自身產(chǎn)酸導(dǎo)致培養(yǎng)液pH不斷降低。因此,通過對培養(yǎng)液初始pH的調(diào)節(jié),可以間接的對菌體生長及富硒過程產(chǎn)生影響。初始pH對植物乳桿菌富硒量影響見圖6。

圖6 初始pH對植物乳桿菌富硒量的影響Fig.6 Effect of initial pH on enriched amount of Lb-30

如圖6所示,當(dāng)初始pH為5.5時,菌體的富硒含量最大為739.544 μg/g。而過酸過堿條件都將會對菌體的生長及富硒代謝過程產(chǎn)生抑制作用,因此,選取初始pH5.5時為菌體的最佳富硒條件。

2.4.4 接種量對植物乳桿菌富硒含量的影響 適宜的接種量有利于微生物菌體生物量的迅速增大,從而吸收富集培養(yǎng)液中更多的Se(IV)。接種量對植物乳桿菌富硒含量的影響見圖7。

圖7 接種量對植物乳桿菌富硒量的影響Fig.7 Effect of inoculation volume on enriched amount of Lb-30

如圖7所示,當(dāng)菌體接種量達(dá)到4%,富硒含量趨于穩(wěn)定。如果繼續(xù)增加接種量,培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分會大量消耗,在培養(yǎng)后期菌體之間相互競爭,富硒含量反而下降。因此,選取4%的接種量為植物乳桿菌的最佳接種量,富硒量高達(dá)702.394 μg/g。

2.5 響應(yīng)面分析優(yōu)化植物乳桿菌富硒條件

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken原理,綜合單因素實驗結(jié)果,選取3個對植物乳桿菌富硒含量影響顯著的因素,分別為加硒時間(A)、初始pH(B)、接種量(C)為自變量,以菌體富硒含量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)曲面設(shè)計實驗。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert軟件對表中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到菌體富硒量(μg/g)對加硒時間(A),初始pH(B)、接種量(C)的二次多項回歸模型方程為:

富硒量(μg/g)=816.98-82.57×A-25.03×B+28.90×C-15.41×A×B-25.78×A×C-25.00×B×C-209.53×A2-107.56×B2-72.50×C2

表4 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析Table 4 The variance analysis for regression model

注:** 影響極顯著p<0.01,* 影響顯著p<0.05,N 影響不顯著p>0.05。

對二次多項回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表4。模型顯著性p<0.0001,表明模型高度顯著;各因素中一次項(A、B、C)、二次項(A2、B2、C2)及交互項(AC、BC)的p值均<0.05,說明其對響應(yīng)值影響顯著;模型失擬項p值0.7946>0.05,從另一方面說明模型具有良好的擬合度。

2.5.2 響應(yīng)曲面圖形分析 根據(jù)回歸方程繪制相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線分析圖,可以直觀的看出各因素及它們間的交互作用對菌體富硒量的影響。通過等高線的線密度以及形狀可以反映交互作用的強(qiáng)弱,即等高線越密集呈現(xiàn)橢圓形表示兩因素的交互作用顯著,反之則表示交互作用不顯著[16]。

如圖8所示,加硒時間與接種量(圖8C)、初始pH與接種量(圖8E)之間表現(xiàn)出良好的交互作用,該結(jié)果與表4的方差分析結(jié)果一致。通過二次多項回歸模型方程得到最優(yōu)富硒培養(yǎng)條件組合方案:加硒時間7.59 h、初始pH5.43、接種量3.26%,預(yù)測富硒量為830.960 μg/g。

為實驗方便可行,將最優(yōu)條件修正為:加硒時間7.6 h、初始pH5.5、接種量3%。按照最佳培養(yǎng)條件組合進(jìn)行富硒能力實驗,確定模型與實驗的相符性,得到植物乳桿菌的實際富硒含量為839.635 μg/g。實際富硒含量與回歸方程接近,證明了模型的可靠性。優(yōu)化后植物乳桿菌硒轉(zhuǎn)化率高達(dá)43.60%。

3 結(jié)論與討論

本實驗采用Box-behnken設(shè)計對植物乳桿菌富硒條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過回歸分析建立了富硒含量對培養(yǎng)條件的二次回歸模型,其回歸方程的決定系數(shù)達(dá)到了0.9917。得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件為:亞硒酸鈉添加量為5.0 μg/mL;加硒時間為7.6 h、初始pH為5.5、接種量3%,培養(yǎng)時間為36 h。菌體富硒含量高達(dá)839.635 μg/g,與理論值(830.960 μg/g)的相對誤差為1.03%,表明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化植物乳桿菌Lb-30富硒量的培養(yǎng)條件是可行的,比優(yōu)化前提高了21.88%。

通過上述實驗可知,高濃度的亞硒酸鈉添加量會對菌體生長起到延遲作用,即會對菌體的富硒過程產(chǎn)生影響,因此,我們延長菌體培養(yǎng)時間或者通過延長加硒時間,縮短菌體在延遲期對硒因子的適應(yīng)階段;另外,乳酸菌產(chǎn)酸,培養(yǎng)過程中pH會發(fā)生變化,在后續(xù)實驗中可以討論pH與富硒量的相關(guān)性,通過分批補(bǔ)料調(diào)控培養(yǎng)液恒定pH或在培養(yǎng)過程中以低濃度流加硒的辦法來實現(xiàn)植物乳桿菌的最大富硒量。

圖8 兩因素交互作用對植物乳桿菌富硒含量的影響Fig.8 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects of initial pH,selenium adding time and inoculation volume on selenium enrichment of Lb-30

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Optimal condition for selenium-richLactobacillusplantarumcultivation

LIANG Jin-zhong,WANG Yi-xue,MEI Jian-qiu

(Key Laboratory for Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Heilongjiang Province,Harbin 150076,China)

LactobacillusplantarumLb-30 was cultured to uptake and accumulate Se in modified MRS satisfying the dietary requirements of Se for huaman. And single factor test including Na2SeO3concentration,culture time,selenium adding time,initial pH,and inoculation volume were optimized with Box-behnken design. The optimum culture conditions were as follows:Na2SeO3concentration 5.0 μg/mL,initial pH5.5,selenium adding time 7.6 h,inoculation volume 3.0%,culture time 36.0 h. The enrichment of selenium was 839.635μg/g after cultivated in optimized medium,which was 1.28 times that of the yield before. It can provide a theoretical basis for the production of selenium-richLactobacillusplantarum.

Lactobacillusplantarum;selenium enrichment;optimization of culture conditions

2016-08-17

梁金鐘(1957-)，男，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)與發(fā)酵工程，E-mail:ljz2050@126.com。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.018