姜春樂，郭秀清，遲靜

（1.桃村獸醫(yī)站，山東 煙臺 265300；2.臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600；3.煙臺市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 煙臺 264100）

齊多夫定對J亞群禽白血病病毒的體內外抑制作用

姜春樂1，郭秀清2，遲靜3

（1.桃村獸醫(yī)站，山東 煙臺 265300；2.臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600；3.煙臺市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，山東 煙臺 264100）

禽白血病病毒與人的HIV同屬于反轉錄病毒，鑒于已有多種藥物在控制HIV中起到了重要作用，本研究試圖探索此類藥物在輔助禽白血病病毒凈化中的可行性，分別在體內和體外觀察了齊多夫定對J亞群禽白血病病毒的抑制作用。首先通過在培養(yǎng)液中添加不同藥物濃度連續(xù)傳代以及利用CCK法測定細胞活性的方法，確定了在培養(yǎng)液中添加藥物不超過5μg/ml的藥物濃度對于DF-1細胞的復制沒有影響。體外試驗證實，當在培養(yǎng)液中添加5μg/ ml的藥物時可以顯著抑制J亞群禽白血病病毒在DF-1細胞上的復制，與不添加藥物組差異顯著；體內實驗證實，在10mg/只/d連續(xù)用藥7d情況下感染J亞群禽白血病病毒雞群在前六周內病毒血癥完全消除。本研究證實了齊多夫定在體內和體外對J亞群禽白血病病毒均具有明顯的抑制作用，這有助于在檢測淘汰的同時通過藥物的輔助加速不同雞群中禽白血病病毒的凈化進程。

禽白血病病毒；齊多夫定；體內；體外；抑制作用

禽白血病(Avian leukemia,AL)是由禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種良性和惡性腫瘤性疾病，臨床上多以免疫抑制、生長抑制和多器官組織出現腫瘤等為主要特征[1]。根據病毒囊膜蛋白和與病毒的宿主特異性相關的 gp85蛋白抗原性差異，禽白血病毒可分為A-J共10個亞群，其中只有A、B、C、D、E和J亞群能感染雞[2-3]。

在上世紀80年代以前，A、B亞群ALV是引起雞群淋巴性白血病和各類型腫瘤的主要亞群，但在80年代中期，西方大型種雞公司已基本消除了雞群中A、B亞型ALV的感染。而從上世紀90年代起，J亞群禽白血病在白羽肉雞中廣泛流行，給肉雞業(yè)造成了很大的經濟損失。經過幾十年的凈化措施，國際上多數大型種雞公司也已基本凈化了ALV-J感染。由于中國在禽白血病方面一直未進行全面的凈化措施，我國不同雞群中禽白血病病毒感染仍較普遍，其中J亞群多見報道[4-8]，并且還不斷有新的K亞群出現[9-10]。

禽白血病病毒與人的HIV同屬于反轉錄病毒，與HIV一樣，目前尚無有效的商品化疫苗用于ALV的預防。鑒于ALV主要通過垂直傳播，國際上主要通過凈化措施來控制 ALV，檢測和淘汰ALV陽性種雞。目前，國際上用于原種雞群的最優(yōu)凈化方案是對核心雞群全部采血接種 DF-1細胞，9d后檢測P27抗原，凡陽性者全部淘汰。但是這一程序需要較高的實驗室檢測水平，也不適于大量樣品的檢測。

在HIV的控制中，通過多種藥物及其組合已經較好的控制了HIV。我們有興趣知道類似的藥物是否可以通過控制HIV類似的策略來阻斷或者至少降低ALV-J的感染。為此，本研究觀察了齊多夫定對J亞群禽白血病病毒在體內和體外的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒與抗體 對內源性E亞群ALV有抗性的DF-1細胞購自美國ATCC，其基礎培養(yǎng)液為DMEM（pH7.2，GIBCO，USA），生長液中添加10%胎牛血清（FBS），維持液中添加2%FBS。ALVJ的NX0101株是2001年由本實驗室從中國的寧夏回族自治區(qū)某父母代種雞場分離到的野毒株[11]，其傳染性克隆rNX0101由本實驗室制備和保存[12]。rNX0101在DF-1細胞上增殖后，上清液按照Reed-Muench法方法測定其TCID50為10-2.5TCID50/0.1mL。

1.2 藥物與疫苗 藥物齊夫多定（AZT）為葛蘭素威爾康公司生產的藥物原粉。在細胞上使用時，用細胞基礎培養(yǎng)液DMEM配制所需藥物濃度；在體內實驗中使用時，用生理鹽水配制所需藥物濃度。雞新城疫滅活疫苗以及 H9亞型禽流感滅活疫苗均購自梅里亞公司。

1.3 不同濃度AZT對DF-1細胞復制和活性的影響 AZT濃度過高會對DF-1細胞引起損傷，導致ALV-J的復制受到影響。為了確定對DF-1細胞復制的安全藥物濃度，本研究通過在不同藥物濃度培養(yǎng)液中連續(xù)傳代和CCK細胞毒性測定兩種方法來評估藥物的安全使用范圍。首先在細胞培養(yǎng)液中分別添加 120、100、60、40、20、5、3、2、1、0.5μg/ml的AZT，然后將上述不同濃度AZT培養(yǎng)液進行DF-1細胞的連續(xù)傳代，至少傳代15代以上，表示該藥物濃度對DF-1細胞的復制沒有影響。此外，通過 CCK-8試劑盒（Vazyme Biotech， China）測定了不同藥物濃度對DF-1細胞的活性影響，具體操作參見試劑盒說明書[13]。

1.4 不同濃度AZT對ALV-J在DF-1細胞復制的抑制作用 在一個24孔細胞培養(yǎng)板中接種同等數量的DF-1細胞，待細胞長成為單層后1～20孔每孔接種rNX0101株500個TCID50，剩余21～24孔不添加藥物作為空白細胞對照。2h后1～4孔換為維持液A，其中含有5μg/ml的AZT，5～8孔、9～12孔、13～16孔分別更換為含有 3、2、1μg/ml AZT的維持液，17～20孔不添加藥物。接種ALV-J培養(yǎng)7d后，收取24個孔細胞上清液，以ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒測定CEF細胞中的p27抗原并記錄各個孔的S/P值，同時對不同組的細胞上清液按照Reed-Muench法方法測定其TCID50。

1.5 不同濃度AZT對海蘭褐生產性能的影響 從經過ALV凈化的種雞場購買80只1日齡海蘭褐商品代蛋雞，1日齡頸靜脈采血分離病毒，經鑒定無ALV、REV和MDV感染，將其分為A、B、C、D 4個組。其中A組不服用藥物，作為空白對照組；B組從1日齡起每只雞每天肌肉多點5mg AZT，連續(xù)用藥 7d；C組從 1日齡起每只雞每天肌肉多點10mg AZT，連續(xù)用藥7d；D組從1日齡起每只雞每天肌肉多點20mg AZT，連續(xù)用藥7d。7日齡時免疫H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗。分別在第 14、21、28、35、42、49、56、63d時對各組稱重，并同時采集血清以血凝抑制實驗（HI）分別測定針對H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗抗體，觀察不同藥物濃度對海蘭褐雞體重和免疫機能的影響。

1.6 不同劑量AZT對ALV-J在海蘭褐雞內復制的抑制作用 從經過ALV凈化的種雞場購買80只1日齡海蘭褐商品代蛋雞，1日齡頸靜脈采血分離病毒，經鑒定無ALV、REV和MDV感染，將其分為A、B、C、D 4個組，其中A組為空白對照組；B組從1日齡起每只雞每天口服5mg，連續(xù)服藥7d；C組從1日齡起每只雞每天口服10mg，連續(xù)服藥7d；D組僅攻毒ALV-J不用藥。在首次用藥后 2h對 B、C、D三個組均以 rNX0101感染，104TCID50/只。從第 一 周起每 周 采 集 抗 凝 血 ，4°1500rpm離心后接種CEF細胞進行病毒分離，檢測各組病毒血癥的陽性情況。

2 結果

2.1 不同AZT添加濃度對DF-1細胞復制和活性的影響 當在培養(yǎng)液中加入濃度高于 5μg/ml的AZT時，DF-1細胞均無法正常傳代；當在培養(yǎng)液中加入濃度3μg/ml及以下的AZT時，DF-1細胞可連續(xù)傳代40代以上（表1）。在培養(yǎng)液中分別添加5、3、2、1、0.5μg/ml的AZT，使用CCK-8試劑盒測定藥物濃度對細胞活性，在450nm下分別測定細胞的吸光度，連續(xù)觀察160h，以吸光度值為縱坐標，時間為橫軸，繪制折線圖（見圖 1），顯示所用藥物濃度都對細胞活性有輕微影響，但差異不明顯。

表1 添加不同濃度AZT對DF-1細胞傳代的影響

圖1 不同藥物濃度下吸光度值

2.2 不同AZT添加濃度對ALV-J在DF-1細胞復制的抑制作用 接種NX0101的DF-1細胞在分別含有 5、3、2、1、0.5μg/ml AZT的維持液中培養(yǎng) 7d后，收獲細胞上清液，以 ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒測定CEF細胞中的p27抗原并記錄各個孔的S/P值，以ELISA檢測的S/P值為縱軸，AZT添加濃度為橫軸繪制柱形圖 （圖2），可明顯觀察到AZT明顯的抗病毒作用。同時對各組病毒含量（TCID50）進行了測定（表2）。結果顯示隨著藥物濃度的增加，rNX0101的復制受到的抑制作用隨之增強。

表2 不同藥物添加濃度對ALV-J在DF-1細胞復制的抑制作用

圖2 不同藥物添加濃度對ALV-J在DF-1細胞復制的抑制作用

2.3 不同濃度AZT對海蘭褐雞生產性能的影響 給海蘭褐雞每天分別服用5、10mg AZT和20mg，并連續(xù)使用7d，觀察發(fā)現使用5mg和10mg AZT雖然造成了雞比空白對照組的體重輕微下降，但差異不明顯（圖3），20mg組有明顯死亡發(fā)生，這可能與對幼年小雞注射過量液體有關，對于該組我們在后續(xù)的實驗中將不予討論。在免疫H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗后4、6、8周后測定針對H9亞型禽流感滅活疫苗和新城疫滅活疫苗抗體顯示服用藥物對兩種疫苗抗體滴度與空白對照組差異不顯著，在某些情況下甚至會高于空白對照組（表3、表 4）。

圖3 每周各組體重平均值柱狀圖

表3 用藥組和不用藥組在免疫新城疫后HI抗體滴度的影響

表4 用藥組和不用藥組在免疫禽流感H9疫苗后HI抗體滴度的影響

2.4 不同劑量AZT對ALV-J在海蘭褐雞內復制的抑制作用 未使用AZT的ALV-J感染組從第一周至第九周表現為持續(xù)病毒血癥陽性，并維持在一個較高的水平。而使用10mg AZT的感染組到42d為止均未出現病毒血癥。使用5mg AZT的感染組盡管前6周沒有完全消除ALV-J的感染，但病毒血癥陽性率也明顯低于不用AZT的感染組，但病毒血癥在第九周時完全消失（表5）。

表5 不同日齡病毒分離陽性率

3 討論

近年來，不同雞群感染ALV的報道在中國越來越多，特別是在一些地方品系雞群中ALV感染的陽性率非常高，腫瘤類型也多種多樣[14-15]。鑒于目前尚未有商品化的疫苗能夠用于控制ALV，一些種雞場不得不針對ALV開始實施嚴格的凈化措施。目前，國際上用于原種雞群的最優(yōu)凈化方案是對核心雞群全部采血接種DF-1細胞進行外源性ALV的分離鑒定并全部淘汰陽性，這已經成為種雞群凈化的國際金標準。但是在執(zhí)行這一標準時遇到了很多困難，因為在中國很多雞群中ALV陽性率過高導致凈化中淘汰過多嚴重影響了進化的進程[16]。

ALV與人獲得性免疫缺陷病毒（HIV）同屬于反轉錄病毒科，它們的基因組結構非常相似，即5'-gag-pol-env-3'，其中pol基因編碼位于核芯中的反轉錄酶（RT）和整合酶（IN，P32），RT具有依賴RNA和依賴 DNA的聚合酶活性，IN是病毒核酸整合進宿主細胞所必須的，能將病毒核酸整合進宿主細胞染色體基因組中。針對這一特性，目前已經有很多藥物應用于HIV的控制，如目前廣泛使用的AZT[17-19]。AZT的分子結構與脫氧胸腺嘧啶核苷酸結構很相似，逆轉錄酶錯將其利用，但因其脫氧核糖的第3位缺少羥基，不能與另一核糖核苷酸上第5位羥基與磷酸酯化相連，不能形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA鏈的編碼被中斷，因而抑制了病毒的復制。泰國一項大規(guī)模的研究結果顯示，在妊娠晚期和分娩期給予葛蘭素威爾康公司生產的AZT使HIV的母嬰傳染率降低一半[20]。這種策略是否可以用于同樣主要依靠垂直傳播的ALV的控制呢？本研究從體內和體外兩個方面觀察了AZT對ALV-J復制的抑制作用。

在進行這一研究前確保所使用的藥物濃度不會對宿主細胞或動物機體造成過度損傷是十分必要的，如果細胞狀態(tài)較差會導致ALV-J在細胞上不能復制，而這種抑制并不是藥物本身對ALV-J的抑制作用。目前常用的方法是用CCK測定使用藥物后的細胞活性，利用這一方法測定結果顯示在添加5μg/ml濃度以下情況下，DF-1細胞的活性幾乎不受影響。此外，本研究還通過DF-1細胞在添加不同濃度AZT的細胞培養(yǎng)液中連續(xù)傳代來不同濃度對DF-1細胞復制的影響，結果顯示在添加3μg/ml的培養(yǎng)液中DF-1細胞可以連續(xù)傳代40代以上。在雞體中我們觀察了不同藥物濃度對雞體重以及免疫機能的影響，結果顯示在每天使用5mg情況下雞的體重與免疫機能幾乎不受影響。在此基礎上我們分別通過在DF-1細胞接種ALV-J和給海蘭褐雞感染ALV-J后使用不同濃度AZT的方式評估了AZT在體內和體外對ALVJ復制的抑制作用，結果顯示不管是體內還是體外AZT均能夠顯著抑制ALV-J的復制。

考慮到AZT在控制 HIV過程中產生的大量耐藥毒株的報道[21-22]，本研究建議 AZT的使用不能維持過長的時間特別是不能一直持續(xù)用藥，為此本研究僅用藥7d即停止喂藥，即便如此，AZT對ALV-J的抑制作用仍然是非常明顯的，很多ALV-J感染雞在后期的連續(xù)觀察中病毒血癥為陰性。特別是當每只雞服用3mg AZT情況下，所有雞在63d時病毒血癥全部轉為陰性。

需要強調的是，藥物的使用不能夠替代針對ALV的凈化，因為它無法確保使感染雞的病毒血癥100%消除。因此它的作用主要是針對一些感染率極高的品系，如中國一些非常寶貴的地方品系雞群，在進行凈化的同時以藥物降低病毒血癥陽性率來加速凈化的進程，因此僅可以作為凈化措施的補充。這一措施還有一個潛在的優(yōu)勢是，通過藥物的使用降低了ALV的病毒血癥水平，這有助于雞體產生針對ALV的抗體加速清除ALV。

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