易巧　劉緒平　張銀花

【摘要】 目的：建立苯甲醇微生物限度檢查法并進(jìn)行方法適用性實驗。方法：按《中國藥典》2015年版四部制劑通則1105、1106、1107項下要求進(jìn)行實驗。需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查和控制菌檢查均采用薄膜過濾法，采用上述方法對苯甲醇藥用輔料各實驗菌進(jìn)行回收率實驗，并對控制菌檢查方法進(jìn)行適用性實驗。結(jié)果：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)驗證實驗中各菌的回收比值均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定，控制菌檢查方法可行。結(jié)論：該方法適用于苯甲醇輔料的微生物限度檢查。

【關(guān)鍵詞】 苯甲醇輔料； 微生物限度； 薄膜過濾法； 方法學(xué)驗證

【Abstract】 Objective：To establish a method of microbial limit test for pharmaceutical excipient benzyl alcohol and make a applicability test for this method.Method：The test method was carried out according to the raw material and pharmaceutical excipients requirements in volume Ⅳ of Chinese Pharmacopoeia 2015.The membrane filtration method was applied to the tests for total viable aerobic count，total combined yeasts and molds count detection and specified bacteria.The bacteria，fungi or yeasts count method for microbial limit test was validated as described above for each of the microorganism tested.And the method for specified bacteria test was also validated.Result：The results showed that the recovery ratios of all the tested strains were in accordance with the acceptance criteria of the pharmacopoeia and the method for specified bacteria test was reliable.Conclusion：The method is suitable for the microbial limit test of pharmaceutical excipient benzyl alcohol.

【Key words】 Pharmaceutical excipient benzyl alcohol； Microbial limit test； Membrane filtration method； Method validation

First-authors address：Jiangxi Institute for Drug Control，Nanchang 330029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.013

微生物檢查作為藥品安全的重要指標(biāo)，其標(biāo)準(zhǔn)制定也隨著藥品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及對藥品質(zhì)量高要求的需求而不斷提高。2015年版《中國藥典》對微生物限度檢查法做了較大的修訂，新版藥典將2010年版藥典附錄中的Ⅺ J微生物限度檢查法拆分為三個部分，分別為微生物計數(shù)法、控制菌檢查法和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中檢驗所用實驗菌液、檢驗方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等都做了不同程度的更改。新版藥典更加關(guān)注生產(chǎn)過程中的微生物控制，在藥品生產(chǎn)、儲藏和流通各個環(huán)節(jié)中，藥品生產(chǎn)企業(yè)均應(yīng)嚴(yán)格遵循GMP的指導(dǎo)原則。制劑、原料及輔料、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度與2010年版《中國藥典》比較給出了具體的限度標(biāo)準(zhǔn)。本文按照2015年版《中國藥典》的操作要求及指導(dǎo)原則，對苯甲醇藥用輔料微生物限度檢查法進(jìn)行研究及適用性實驗，以確定出適宜、有效的檢查方法[2]。苯甲醇也稱芐醇，英文名Benzyl alcohol，是最簡單的含有苯基的脂肪醇，苯甲醇為無顏色透明液體，有微弱的芳香氣味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑[3-4]。苯甲醇用途廣泛，主要應(yīng)用于環(huán)氧樹脂及涂料領(lǐng)域，也廣泛應(yīng)用于日化、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。近年來隨著相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)外對苯甲醇的需求量不斷增加，2011年醫(yī)藥領(lǐng)域苯甲醇的消費量約為1200 t。由于其具有麻醉、鎮(zhèn)痛的功效，苯甲醇在制劑中用作防腐劑和局部止痛劑，但因不良反應(yīng)較大，嬰兒使用時有過致死案例，目前主要用作防腐劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BKQP-50L型高壓蒸汽滅菌器（濟南博鑫生物技術(shù)有限公司）；M1-211A微波爐（美的集團(tuán)有限公司）；XP-S電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SW-CJ-2D凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；HWS-250恒溫恒濕實驗箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；3758CN低溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技中國有限公司）；HH.S21-6電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；ZW-2008智能集菌儀（溫州維科生物實驗設(shè)備有限公司）；薄膜過濾器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 主要試劑 苯甲醇，批號：20151201、20151202、20151203三個批次，由江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司提供；培養(yǎng)基有：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號160119；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號160128；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號160119；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號151222；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，批號：160203；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號160614；麥康凱液體培養(yǎng)基，批號160511；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號160511；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號151124；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，批號151102，以上培養(yǎng)基均來源于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。實驗菌種有：枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B） 10104]、大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 驗證方法

1.3.1 實驗菌株菌液制備 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置35 ℃培養(yǎng)24 h，分別取以上新鮮培養(yǎng)物各1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-3～10-7，做活菌計數(shù)備用。將白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基置25 ℃培養(yǎng)2 d，取新鮮培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-4，做活菌計數(shù)備用。將黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基置25 ℃培養(yǎng)7 d，加5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉孢子洗脫，吸取出孢子懸液1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比后，取1 mL稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-4，做活菌計數(shù)備用。

1.3.2 供試液制備 取供試品10 mL，置無菌錐形瓶中，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，混勻，作為1∶10供試液，備用。

1.3.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)適用性實驗

1.3.3.1 實驗組 （1）需氧菌計數(shù)：取上述1∶10供試液1 mL，置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾法，每筒用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的實驗菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉），濾干，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，實驗平板置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)3 d，白色念珠菌、黑曲霉分別培養(yǎng)5 d，逐日觀察平板生長情況。（2）霉菌和酵母菌計數(shù)：取上述供試液10 mL，置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾法，每筒用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的實驗菌（白色念珠菌、黑曲霉），濾干，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，實驗平板置25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，逐日觀察平板生長情況。

1.3.3.2 供試品對照組 取上述1：10供試液，以稀釋液代替菌液，同實驗組操作，測定供試品本底菌落數(shù)。

1.3.3.3 菌液對照組 取相應(yīng)稀釋液替代供試液，同實驗組操作加入實驗菌液并進(jìn)行微生物回收實驗。

1.3.3.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 計數(shù)方法適用性實驗中，實驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。

1.3.4 控制菌檢查方法的適用性實驗

1.3.4.1 金黃色葡萄球菌檢查 實驗組：取上述1∶10供試液10 mL，置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，加入不大于100 cfu金黃色葡萄球菌實驗菌（將實驗菌加入最后一次沖洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)72 h，觀察平板生長情況。陰性對照組：取稀釋液10 mL替代1∶10供試液，照金黃色葡萄球菌檢查法操作。

1.3.4.2 銅綠假單胞菌檢查法 實驗組：取上述1∶10供試液10 mL，置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，加入不大于100 cfu銅綠假單胞菌實驗菌（將實驗菌加入最后一次沖洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)72 h，觀察平板生長情況。陰性對照組：取稀釋液10 mL替代1∶10供試液，照銅綠假單胞菌檢查法操作。

1.3.4.3 大腸埃希菌檢查法 實驗組：取上述1∶10供試液10 mL，置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾法，每筒用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，濾干，取膜置于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入不大于100 cfu的大腸埃希菌液，35 ℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱瓊脂平板上菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行分離純化，經(jīng)純化后的培養(yǎng)物，接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察MUG培養(yǎng)基顏色變化。陰性對照組：取稀釋液10 mL替代1∶10供試液，照大腸埃希菌檢查法操作。

1.3.4.4 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查法 實驗組：將上述1：10供試液置于25 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h。取上述預(yù)培養(yǎng)供試液10 mL（2份），置薄膜過濾器中，采用薄膜過濾法，每筒用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，分別加入不大于100 cfu的大腸埃希菌液和不大于100 cfu的銅綠假單胞菌液（將實驗菌液加入最后一次沖洗液中），取膜置于100 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，上述培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，置35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板生長情況。若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，代表檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。陰性對照組：取稀釋液10 mL替代1∶10供試液，照耐膽鹽革蘭陰性菌檢查法操作。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法適用性實驗結(jié)論 在三次獨立的需氧菌計數(shù)方法適用性實驗中，5種菌株的回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合藥典規(guī)定。因此可照此方法測定苯甲醇的需氧菌總數(shù)。在三次獨立的霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性實驗中，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合藥典規(guī)定。因此可照此方法測定苯甲醇的霉菌和酵母菌總數(shù)。見表1。

2.2 控制菌檢查方法學(xué)適用性實驗結(jié)論 在進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢查、銅綠假單胞菌檢查、大腸埃希菌檢查和耐膽鹽革蘭陰性菌檢查四種控制菌的適用性實驗中，實驗組均檢出陽性實驗菌，陰性對照組無菌生長。因此，可照此方法進(jìn)行苯甲醇的控制菌檢查。見表2～5。

3 討論

與2010年版藥典相比，2015年版藥典在微生物控制方面做了很大幅度的改變。新版藥典將“方法驗證”改為了“方法適用性”，適用性是把實驗條件、供試品等因素作為一個整體來評價，更為完整科學(xué)。新版藥典中的培養(yǎng)體系也有變化，首先是培養(yǎng)基的改變，需氧菌計數(shù)所使用的培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基[5-9]，霉菌和酵母菌計數(shù)使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度也做出了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，需氧菌計數(shù)培養(yǎng)溫度由35～37 ℃調(diào)整為30～35 ℃，霉菌和酵母計數(shù)培養(yǎng)溫度由25～28 ℃變?yōu)?0～25 ℃。測試菌株也發(fā)生了改變，采用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌三株菌進(jìn)行方法適用性實驗，其中銅綠假單胞菌替換了2010版藥典中的大腸埃希菌。而且需氧菌計數(shù)的適用性實驗中，需要使用5種菌株，相較于2010版藥典的3菌株增加了白色念珠菌和黑曲霉[10-11]。此外，計數(shù)回收方法中增加了新的檢測方法-MPN法，可作為平板計數(shù)法和薄膜過濾法不適用時的補充。

控制菌檢查方面，新版藥典控制菌檢查法除梭菌和白色念珠菌外，其余檢查指標(biāo)在預(yù)培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)這一步驟中都統(tǒng)一使用了胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，大大方便了實驗操作。新版藥典新增了耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查，替代了《中國藥典》2010年版的大腸菌群的檢查。在各控制菌項下，生化實驗和“應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定實驗”改為“采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定”，檢測方法更加靈活多變，實驗室可以根據(jù)自身情況靈活選擇適宜的方法，調(diào)高檢驗效率和結(jié)果可靠性[12-14]。

藥用輔料是藥品重要的組成部分，它們的質(zhì)量關(guān)系到所有藥品的安全性[15-16]。與原版藥典相比，2015年版藥典對原料及輔料的微生物限度控制更加嚴(yán)格規(guī)范[17-18]?！吨袊幍洹?010年版附錄ⅪJ微生物限度檢查法中對“原料及輔料”的微生物限度的描述為“參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行”[19]。而《中國藥典》2015年版四部1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中，第5點明確規(guī)定了“非無菌藥用原料及輔料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”[20]。其中，需氧菌總數(shù)限度為103 cfu/g或cfu/mL，霉菌和酵母菌總數(shù)限度為102 cfu/g或cfu/mL?？刂凭醋鼋y(tǒng)一規(guī)定，需要根據(jù)原輔料及其制劑的特性和用途、制劑的生產(chǎn)工藝等因素檢查具有潛在危害的微生物[17-18]。由于苯甲醇為藥用輔料，考慮在醫(yī)藥領(lǐng)域中苯甲醇主要作為防腐劑、局部止痛及藥物溶劑作用，實驗設(shè)計控制菌檢查大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。

苯甲醇作為防腐劑廣泛應(yīng)用于藥品制劑中，為更好的控制本產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究建立了其微生物檢查方法，并對方法適用性進(jìn)行了研究。由于苯甲醇作為防腐劑具有一定的抗菌作用，采用平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)適用性實驗時，發(fā)現(xiàn)本品對實驗菌株具有較強的抑制能力，回收率比值達(dá)不到要求。為消除苯甲醇的抑菌干擾，本文采用薄膜過濾法進(jìn)行菌落計數(shù)檢查和控制菌檢查，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，從而保證臨床用藥安全有效。

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（收稿日期：2016-12-30） （本文編輯：周亞杰）