尹智慧，孫長海，方洪壯

(佳木斯大學 藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

研究報告

槲皮素與桑色素ESI-MS裂解行為的比較分析

尹智慧，孫長海，方洪壯*

(佳木斯大學 藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

運用量子化學方法輔助解析并比較槲皮素與桑色素在電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-MS)負離子模式下的裂解行為。依據(jù)密度泛函理論(Density functional theory，DFT)，在B3LYP/6-31G(d)水平，對槲皮素與桑色素的分子空間構(gòu)型進行優(yōu)化，確定穩(wěn)定的幾何構(gòu)型與去質(zhì)子化位點，在RB3LYP/6-31+G(2d,2p)水平，計算相對碎裂電壓下的二級質(zhì)譜中碎片離子處于穩(wěn)定狀態(tài)時的能量，通過比較準分子離子穩(wěn)定構(gòu)型并結(jié)合基組重疊誤差(Basis set superposition error，BSSE)校正后的鍵解離能(Bond dissociation energy，BDE)，推導了質(zhì)譜碎裂過程。結(jié)果顯示：槲皮素的穩(wěn)定構(gòu)型為A，B，C環(huán)處于同一平面，桑色素上的2′-OH使得B環(huán)與AC環(huán)之間翻轉(zhuǎn)一定角度，二面角D(1,2,1′,6′)為-134.662 4°。槲皮素與桑色素的質(zhì)譜裂解過程主要通過C環(huán)跨環(huán)裂解產(chǎn)生，且具有多種開裂方式，開裂先后順序為：1,2開裂、0,2開裂、1,3開裂、1,4開裂與0,4開裂，分別生成碎片離子1,2A-,0,2A-,1,3A-,1,4A-與0,4A-，并逐步進行后續(xù)裂解，而2′-OH的存在促進了桑色素的裂解。該研究為進一步揭示黃酮醇類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律提供了理論依據(jù)。

黃酮醇；量子化學；電噴霧離子阱質(zhì)譜；裂解行為

槲皮素與桑色素是植物界中廣泛分布的以C6-C3-C6為基本碳架的黃酮醇類化合物，常以游離態(tài)或糖苷形式存在[1-2]。兩者互為同分異構(gòu)體，化學結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于B環(huán)上的二羥基取代位置不同。在藥理活性方面，槲皮素與桑色素均具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等作用，近幾年被廣泛用于藥品與保健食品的研發(fā)[3-5]。電噴霧電離源(Electrospray ionization，ESI)質(zhì)譜是質(zhì)譜家族中的重要組成部分，雖然其在天然化合物的分析中已得到廣泛的應用，但其質(zhì)譜裂解機理與規(guī)律尚多有空白。質(zhì)譜試驗中，離子化過程非常短暫，難從實驗上觀察裂解過程，而將量子化學計算引入到質(zhì)譜解析中，通過計算分子結(jié)構(gòu)中的電荷密度、軌道、能級等各項參數(shù)，確定分子最穩(wěn)定的電子態(tài)構(gòu)型[6-8]，模擬整個化合物的具體裂解過程[9]，得到有機化合物的質(zhì)譜形成機制等信息，可為譜學試驗結(jié)果的解析提供理論依據(jù)。本研究從分子水平角度上出發(fā)，運用量子化學的計算方法，比較分析了槲皮素與桑色素化合物負離子模式下的電噴霧離子阱質(zhì)譜裂解行為，嘗試揭示槲皮素與桑色素兩黃酮醇類化合物的質(zhì)譜裂解機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent G6310質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品，配ESI源，離子阱質(zhì)量分析器和Data Analysis數(shù)據(jù)處理軟件等。槲皮素對照品(純度>98%,天津一方科技有限公司)；桑色素對照品(純度>98%,大連美侖生物技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.2 質(zhì)譜條件

采用ESI負離子模式檢測，噴霧電壓為3.5 kV，毛細管電壓為13 V，毛細管溫度325 ℃，鞘氣和輔助氣為氮氣，鞘氣流速10 L·min-1，輔助氣流速0.15 L·min-1，氦氣為碰撞氣進行碰撞誘導解離分析，碎裂電壓：自動1.00 V，手動0.80 V，掃描范圍：m/z50～330。流動注射泵直接進樣，流速0.5 mL·h-1。

1.3 量子化學計算方法

圖1 槲皮素與桑色素的分子結(jié)構(gòu)與原子編號Fig.1 Structures and atom numbering systems of quercetin and morin

量子化學計算采用Gaussian 03程序完成。在B3LYP/6-31G(d)水平分別進行幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化及頻率計算，確定優(yōu)勢構(gòu)象與去質(zhì)子化位點，且在此基礎(chǔ)上，以同水平計算質(zhì)譜碎片離子穩(wěn)定構(gòu)型，并在RB3LYP/6-31+G(2d,2p)水平計算碎片離子處于穩(wěn)定狀態(tài)時的能量，同時運用Counterpoise Corrrection方法進行基組重疊誤差(Basis set superposition error，BSSE)計算。經(jīng)BSSE校正的鍵解離能(Bond dissociation energy，BDE)根據(jù)公式進行計算：BDE=E(A)+E(B)-E(AB)+E(BSSE)，式中E(AB)為母離子總能量，E(A)為產(chǎn)物碎片離子的能量，E(B)為中性碎片的能量，E(BSSE)為基組重疊誤差值[10-12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)

質(zhì)譜真空條件下，分子主要以能量最低的形式存在，因此本研究以分子穩(wěn)定的空間構(gòu)型優(yōu)化為前提，以保證其后的研究。槲皮素與桑色素的分子結(jié)構(gòu)與原子編號及C環(huán)開裂位置編號如圖1所示，其中，槲皮素：R1=H，R2=OH；桑色素：R1=OH，R2=H。圖1中0，1，2，3，4 為C環(huán)開裂位置的編號，分別對應化學鍵C9—O1，O1—C2，C2—C3，C3—C4，C4—C10。

2.1.1 能量分析 對槲皮素與桑色素可能的初始構(gòu)型分別進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化、頻率計算與能量計算，確定了各自分子穩(wěn)定構(gòu)型，如圖2所示。兩者經(jīng)過分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化及振動分析后的最終結(jié)果均符合收斂標準(Maximum Force 0.000 450；RMS Force 0.000 300；Maximum Displacement 0.001 800；RMS Displacement 0.001 200)，頻率計算均未出現(xiàn)虛頻，說明計算得到的初始構(gòu)型穩(wěn)定，從相應的最終優(yōu)化結(jié)構(gòu)中得到的分子構(gòu)象、能量、二面角、偶極矩等參數(shù)有效可靠，從理論上可作為兩種化合物的分析比較。

2.1.2 構(gòu)型分析 由表1中的數(shù)據(jù)及圖2可以看出，槲皮素分子優(yōu)勢構(gòu)象為A,C,B三環(huán)處于同一平面時的共軛結(jié)構(gòu)，與文獻報道一致[13-14]，此時分子體系的總能量最低，結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，分子中的原子和化學鍵呈自由伸展的狀態(tài)。桑色素分子A環(huán)與C環(huán)仍處于同一平面，但由于B環(huán)2′-位存在羥基，使B環(huán)與C環(huán)之間存在空間位阻，由此使得桑色素的分子優(yōu)勢構(gòu)象為非平面，其B環(huán)與AC環(huán)之間二面角D(1,2,1′,6′)為-134.662 4°。

圖2 槲皮素與桑色素分子的優(yōu)勢構(gòu)象Fig. 2 The preferred conformations of quercetin and morin

表1 槲皮素與桑色素分子優(yōu)勢構(gòu)象的二面角參數(shù)Table 1 The dihedral parameters of the preferred conformations of quercetin and morin

表2 槲皮素與桑色素可能的[M-H]-構(gòu)型的能量Table 2 Energy of [M-H]- for the probable structures of quercetin and morin

2.2 去質(zhì)子化位點

2.3 質(zhì)譜結(jié)果

在質(zhì)譜試驗過程中，槲皮素與桑色素均出現(xiàn)m/z301.0的準分子離子峰，分別將其作為母離子手動提取二級質(zhì)譜圖，得到ESI-MS2質(zhì)譜圖(如圖3所示)。兩種物質(zhì)的分子在電噴霧離子阱質(zhì)譜中的碎片離子基本相同，說明可能具有相同的裂解方式。分析圖3發(fā)現(xiàn)，槲皮素的二級質(zhì)譜圖產(chǎn)生的碎片中，碎片離子m/z150.9，178.8的豐度最為明顯，而桑色素則為m/z124.9，150.9最明顯，兩者中等質(zhì)量數(shù)的碎片離子峰居多，且相對峰強度較大，推測兩種黃酮醇在質(zhì)譜碎裂過程中主要發(fā)生了環(huán)開裂現(xiàn)象，此外還經(jīng)歷了丟失中性H2O，CO和CO2等過程。

圖4 槲皮素與桑色素的跨環(huán)開裂方式Fig.4 The ways of cross-ring cleavages for quercetin and morin

2.4 量化計算

黃酮醇類化合物在質(zhì)譜裂解過程中由于苯環(huán)具有較大穩(wěn)定性不易開裂，因此主要發(fā)生C環(huán)的retro-Diels-Alder(RDA)裂解[15-18]，裂解產(chǎn)物為A、B環(huán)各自帶有C環(huán)的一部分。幾種裂解方式如圖4所示，相應產(chǎn)物分別用A與B部分表示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在同一裂解方式下槲皮素、桑色素跨環(huán)開裂得到的A部分碎片離子均為同一結(jié)構(gòu)。

為深入探究C環(huán)裂解過程，對幾種跨環(huán)裂解方式進行全面的BDE計算分析?？紤]到E([M-H]-)相較于E(A-)+E(B)的降低除了來自真實的A-與B的相互作用能外，還有一部分是由于兩者的基函數(shù)在[M-H]-體系中的重疊，因此加入基組重疊誤差(BSSE)對BDE結(jié)果進行校正[19]。計算涉及的碎片離子均為能量達到最低時的構(gòu)型。槲皮素與桑色素各跨環(huán)裂解方式下的產(chǎn)物示意圖如圖5所示，由“2.2”研究得兩者的[M-H]-能量分別為-1 103.785 8 a.u.與-1 103.766 9 a.u.，相應的BDE值見表3。

Positionofcleavage(開裂位置)Quercetin(槲皮素)Morin(桑色素)E(A-)(a u．)E(B)(a u．)E(BSSE)(a u．)BDE(kJ·mol-1)E(A-)(a u．)E(B)(a u．)E(BSSE)(a u．)BDE(kJ·mol-1)Bond1，2-682 9310-420 81760 0031105 7794-682 9310-420 81070 003174 4067Bond0，2-607 6493-496 07150 0039181 1308-607 6493-496 06660 0041144 7287Bond1，3-569 5421-534 14800 0039261 7124-569 5421-534 13930 0041235 3535Bond1，4-457 4061-646 24920 0040353 4838-457 4061-646 23720 0042335 6848Bond0，4-380 7978-722 72830 0041692 7894-380 7978-722 72860 0043642 6163

圖6 1,2A-離子的靜電勢圖及電荷分布Fig.6 Electrostatic potential surface(A) and charge distribution(B) of fragment ion 1,2A-

槲皮素與桑色素計算所得的BDE能量整體上趨勢相同，按能量大小由低到高依次為BDE1,2

反常的是，圖3中桑色素的碎片離子1,2A-豐度較低，但其理應優(yōu)先開裂且豐度最大，因此對其碎片離子結(jié)構(gòu)做進一步量子化學計算。1,2A-穩(wěn)定構(gòu)型有兩個相鄰的羰基取代基，由于羰基具有較強電負性，在質(zhì)譜試驗中易脫去，猜測可能在碰撞過程中失去了中性CO而裂解。圖6A為碎片離子1,2A-的靜電勢(Electrostatic potential，ESP)圖，ESP圖顯示了碎片離子的靜電勢分布、形狀、偶極矩等相關(guān)信息，能夠直觀地了解相對極性，可用于觀測正負電荷的分布情況和預測反應活性位點。紅色部分為負電荷分布區(qū)，藍色部分為正電荷分布區(qū)。通過比較圖6中相鄰取代的兩個羰基上所覆蓋的顏色發(fā)現(xiàn)，4-位羰基周圍的負電荷分布比3-位羰基更多，可以初步推斷4-位羰基的電負性更強。圖6B為碎片離子1,2A-的電荷分布情況，可以看到所帶負電荷最多的部位在4-位羰基的氧原子上，進一步可以確證，4-位羰基的電負性更強，因此碎裂電壓的驅(qū)動力使其更易脫去進行下一步裂解，生成1,3A-碎片離子。這解釋了在碎裂過程中，雖然1,2A-所需BDE能量更低，但1,3A-碎片離子的相對豐度強于1,2A-的原因。另外，相對碎裂電壓條件下，相較于槲皮素而言，桑色素[M-H]-生成1,2A-所需的BDE能量更低，能夠更早地脫去4-位羰基進行后續(xù)裂解，表現(xiàn)為桑色素1,2A-碎片的離子豐度明顯低于槲皮素的1,2A-。碎片離子1,3A-穩(wěn)定構(gòu)型上還帶有1個羰基與1個氧原子，在一定程度上還可繼續(xù)脫去形成0,4A-碎片離子。

同樣地，碎片離子0,2A-也具有兩個相鄰的羰基，在失去1個羰基后，因無法形成環(huán)狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，即刻失去另一羰基生成0,4A-碎片離子。

除上述主要的C環(huán)跨環(huán)開裂外，兩種黃酮醇[M-H]-還將發(fā)生同環(huán)上的中性碎片丟失，鑒于苯環(huán)的較強穩(wěn)定性，均為C環(huán)脫去而產(chǎn)生。圖7顯示了槲皮素與桑色素的質(zhì)譜裂解途徑及各步裂解過程中失去的中性碎片，出現(xiàn)的碎片均為能量最低態(tài)結(jié)構(gòu)。中性H2O的丟失是通過脫去羥基與氫原子而形成，C環(huán)上3-OH與附近B環(huán)C6′上的氫以H2O的形式脫去，生成m/z283碎片離子。4-位羰基的強電負性有助于脫去CO，生成m/z273碎片離子。1-位氧原子電負性雖不如4-位羰基，但造成相連的C9-O1鍵與O1-C2鍵的極性增加，也有助于脫去氧原子與3-位羥基，生成穩(wěn)定的共軛碎片離子m/z229。m/z257為共同脫去1-位氧原子與4-位羰基所生成的碎片離子，可進一步脫去3-位羥基，生成上述同一碎片離子m/z229。分析發(fā)現(xiàn)，碎片離子m/z273與m/z257的生成存在競爭關(guān)系，通過計算得到槲皮素與桑色素生成m/z273所需能量分別為154.419 1 kJ·mol-1與146.747 5 kJ·mol-1，而m/z257分別為228.627 8 kJ·mol-1與215.690 4 kJ·mol-1，兩者均為m/z273碎片離子優(yōu)先生成，得以繼續(xù)裂解形成m/z229，所以質(zhì)譜試驗結(jié)果中m/z273豐度低于m/z257。槲皮素與桑色素的分子構(gòu)型中，C2-C1′鍵并未形成環(huán)狀體系，在碎裂過程中理應易斷裂而生成m/z193碎片離子，但在質(zhì)譜圖(圖3)中桑色素的碎片離子m/z193豐度極小難以觀察到，推測其原因是由于桑色素的跨環(huán)裂解程度增加，削弱了此碎片離子的生成，而槲皮素的跨環(huán)裂解程度不及桑色素，因此在質(zhì)譜圖中可以觀察到槲皮素的m/z193碎片離子。從兩者分子構(gòu)型區(qū)別的角度上看，2′-OH的存在與偶極矩是造成兩者碎裂途徑差異的重要原因。

圖7 槲皮素與桑色素的質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathways of quercetin and morin

3 結(jié) 論

本文通過運用量子化學計算輔助的方法對槲皮素與桑色素化合物的ESI-MS質(zhì)譜裂解途徑進行了比較分析，依據(jù)密度泛函理論，確定了槲皮素的穩(wěn)定構(gòu)象為A,B,C環(huán)處于同一平面，而桑色素由于2′-OH的存在，產(chǎn)生了空間位阻力，結(jié)果使AC環(huán)與B環(huán)不為平面，推斷出槲皮素與桑色素的去質(zhì)子化位點，均為脫去4′-位羥基上的氫而形成準分子離子。通過綜合分析質(zhì)譜試驗數(shù)據(jù)與量子化學計算結(jié)果，獲得了槲皮素與桑色素碎片的離子穩(wěn)定構(gòu)型以及裂解方式，證明兩者具有相同的質(zhì)譜裂解途徑，但2′-OH的存在不僅增大了桑色素分子的極性，同時促進了桑色素[M-H]-的跨環(huán)裂解。本研究不僅系統(tǒng)地解釋了槲皮素與桑色素的質(zhì)譜碎裂行為，且分析了2′-OH的存在對黃酮醇類化合物的影響，為進一步研究黃酮醇類化合物的質(zhì)譜裂解途徑提供了理論依據(jù)。

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Analysis and Comparison on Fragmentation Behavior of Quercetin and Morin by ESI-MS

YIN Zhi-hui，SUN Chang-hai，F(xiàn)ANG Hong-zhuang*

(Pharmaceutical College，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China)

The fragmentation behaviors of quercetin and morin were analyzed and compared by the quantum chemistry method with electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS) in negative ion mode.Based on the density functional theory(DFT)，at the level of B3LYP/6-31G(d)，quantum chemistry calculation was carried out to optimize the molecular spatial configurations of quercetin and morin，in order to confirm the stable geometric configurations and deprotonation locations of quasi-molecular ions.The energy of fragment ions on the stable state under the relative framentation voltage in the second order mass spectrometry，was calculated at the level of RB3LYP/6-31+G(2d,2p).The fragmentation pathway was deduced by comparing the stable configurations of quasi-molecular ions and combined with basis set superposition error(BSSE)-corrected bond dissociation energy(BDE).The results indicated that the stable configuration of quercetin was that the A，B，C rings stayed in the same plane，but morin was not like this because of the 2′-OH，and the dihedral angle between B ring and AC rings was-134.662 4°.The fragmentation processes of quercetin and morin occurred mainly through the cross-ring cleavages of C ring with various of cleavage ways.The precedence order was：1,2 cleavage，0,2 cleavage，1,3 cleavage，1,4 cleavage and 0,4 cleavage，the fragment ions of1,2A-，0,2A-，1,3A-，1,4A-and0,4A-were generated，respectively.The difference between them was that the existence of 2′-OH on morin facilitated the cross-ring cleavages.Subsequently，the rest of fragment ions were produced step by step.This study provided a theoretical basis for further revealing the fragmentation pathway of flavonol compounds.

flavonol；quantum chemistry；electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)；fragmentation behavior

2016-07-07；

2016-10-20

佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目(LZR2015_022)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.009

O657.63；TQ460.72 6

A

1004-4957(2017)02-0205-07

*通訊作者：方洪壯，教授，研究方向：中藥分析與計算藥物分析，Tel：0454-8611265，E-mail：fhz-chjms@163.com