姚松坪，燕榮，楊少華，彭津津，劉國慶，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)化工與食品加工系，安徽合肥230009；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科學(xué)系，重慶404155）

食品中微生物快速檢測技術(shù)發(fā)展概況

姚松坪1，燕榮1，楊少華1，彭津津2，劉國慶1，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)化工與食品加工系，安徽合肥230009；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科學(xué)系，重慶404155）

食品工業(yè)發(fā)展迅速，但同時(shí)食品安全事故也頻頻發(fā)生，因此越來越多的人開始關(guān)注食品安全。引起食品安全問題的因素有很多，其中由微生物引起的食品腐敗是主要因素。如何快速檢測食品中的微生物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。綜述幾種目前在世界范圍內(nèi)比較先進(jìn)的檢測技術(shù)，比起傳統(tǒng)的檢測手段，更加方便快捷，靈敏度更高。

微生物；快速檢測；食品安全

眾所周知，食物的供給是人類賴以生存和發(fā)展的必要條件，所產(chǎn)生食品安全問題的重要性不言而喻。目前全世界都已經(jīng)開始關(guān)注食品安全問題。在眾多的食品安全事件中，最主要的原因就是微生物及其產(chǎn)生的各種毒素，產(chǎn)生的后果也是最為嚴(yán)重的。如“英國瘋牛病事件”、“香港禽流感事件”、“法國李斯特氏菌病”等。這些食品污染幾乎都是由致病微生物引起。通常能引起食源性疾病的病原體主要有：副溶血性弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、肉毒桿菌以及黃曲霉等[1]。因此，為了快速準(zhǔn)確地檢測這些病原微生物，需要我們進(jìn)一步發(fā)展和完善食品檢測技術(shù)和相關(guān)的檢測系統(tǒng)。

一般情況下，要檢測食品中的微生物多用瓊脂平板培養(yǎng)法，這種方法主要是用培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行培養(yǎng)、分離和純化，然后做相關(guān)生化鑒定，操作過程復(fù)雜并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般需2 d～3 d才能完成試驗(yàn)并給出結(jié)果[2]，無法適應(yīng)快速檢測的需求。因此，研究和建立新的技術(shù)和檢測方法至關(guān)重要。準(zhǔn)確、快速、特異的食品微生物檢測技術(shù)已越來越受到世界各地科學(xué)家們的關(guān)注。隨著生物相關(guān)技術(shù)和微電子技術(shù)的發(fā)展，微生物快速檢測手段也有了較大的突破[3]。目前比較常見的微生物快速檢測方法主要有綜合應(yīng)用免疫學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、微生物學(xué)以及血清學(xué)試驗(yàn)等技術(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對微生物的分離、純化和鑒定，比起傳統(tǒng)的檢測手段，快速檢測更加快捷、方便、靈敏[4]。快速檢測食品中金黃色葡萄球菌相關(guān)系統(tǒng)的連接示意圖見圖1[5]。

圖1 金黃色葡萄球菌快速檢測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Sketch of rapid detection system of Staphylococcus aureus

1 分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是上世紀(jì)80年代興起的一種體外快速擴(kuò)增技術(shù)，在較短的時(shí)間內(nèi)就可擴(kuò)增數(shù)以百萬倍的目標(biāo)基因片段。PCR技術(shù)因擁有輕便、快速、較強(qiáng)特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于食品微生物的快速檢測中，特別適用于突發(fā)性食品安全事件、要求快速給出鑒定結(jié)果的檢測工作以及不易培養(yǎng)或常規(guī)方法難以檢測的微生物[6]。

Delibato等人根據(jù)沙門氏菌的ttrRSBCA基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的底物及探針，并運(yùn)用該方法對大量細(xì)菌和多個肉樣進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示檢測特異性為100%[7]。李金峰[8]等利用多重?zé)晒釶CR技術(shù)特異性的檢測出了肉類中的李斯特菌、沙門菌和大腸桿菌O157∶H7。該方法簡單、快速，能同時(shí)檢測到反應(yīng)系統(tǒng)中的多個目標(biāo)序列，可以節(jié)省時(shí)間、人力、物力和財(cái)力，同時(shí)避免造成污染。然而，盡管其具有高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，但檢測的順利進(jìn)行更是依賴于平穩(wěn)、昂貴、復(fù)雜的精密儀器設(shè)備，因此嚴(yán)重限制了該技術(shù)在我國食品檢測機(jī)構(gòu)的大面積推廣及其應(yīng)用。

1.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片是一種生物芯片，該技術(shù)是通過對微電子技術(shù)和分子生物學(xué)的綜合應(yīng)用，使得被標(biāo)記的基因探針和寡核苷酸發(fā)生雜交反應(yīng)，而后使用相關(guān)的檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，檢測反應(yīng)信號的強(qiáng)弱，因此實(shí)現(xiàn)對被測樣本中的微生物進(jìn)行定量以及定性分析。基因芯片技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、方便的特性，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用到了食品微生物及環(huán)境微生物污染的檢測中。何洋等使用該技術(shù)手段，快速鑒定出食品中的金黃色葡萄球菌[9]，其研究表明該技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性，僅需7 h便可檢測出樣本中的金黃色葡萄球菌，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

2 免疫技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種能同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗原-抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶催化反應(yīng)高效性的固相酶免疫檢測方法，也是相關(guān)測定手段中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其特點(diǎn)主要有：反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、檢測簡單、分析結(jié)果真實(shí)可靠及費(fèi)用低等，同時(shí)，該方法也可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對大量樣品進(jìn)行分析，因此也廣泛應(yīng)用在食品檢測中。趙志晶等[10]建立了一種雙抗酶聯(lián)免疫法，專門用于檢測食品中的大腸桿菌O157∶H7，該方法具有很高的靈敏度，在雞肉與牛奶的污染樣品中檢出大腸桿菌達(dá)到0.1CFU/g（CFU/mL）。

2.2 免疫磁性微球法

免疫磁性微球是一種表面偶聯(lián)有單克隆抗體的磁性微球，其主要特點(diǎn)是孔徑小，超順磁性等。現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在細(xì)胞分離等技術(shù)方面。其原理是，免疫磁性微球可以選擇性地與靶物質(zhì)結(jié)合，使其具有磁性反應(yīng)的特性，并將特異性抗體與磁性顆粒相耦合，這樣顆粒就能與樣本中待檢測的微生物發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)此復(fù)合物經(jīng)過一個磁場裝置時(shí)，這種磁性顆粒就會在外加磁場的作用下，向磁極方向運(yùn)動，其表面吸附的致病微生物也會隨之運(yùn)動，這樣就使致病微生物得到分離和富集，從而與其他復(fù)雜物質(zhì)分離開來[11-12]。

在日常食品分析中，待測樣品通常為固液混合物，但是傳統(tǒng)手段很難將其中少量的微生物有效分離開來。而免疫磁性技術(shù)憑借其獨(dú)特的性能很好地解決了這一問題，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品安全檢測和相關(guān)的研究中。Skjerve等[13]利用該技術(shù)從乳、肉制品中分離沙門氏菌，結(jié)果顯示此方法檢測限為10個/g～20個/g細(xì)菌。

3 代謝技術(shù)

3.1 ATP生物發(fā)光法

ATP（adenosine-triphosphate，ATP）生物發(fā)光法主要用于活菌計(jì)數(shù)，其原理是：ATP作為“能量貨幣”廣泛的存在于各種有生命的有機(jī)體中，而且ATP的含量在活細(xì)胞中是恒定的，活的細(xì)菌體中也有ATP，當(dāng)細(xì)菌死亡后，在細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)酶的作用下，ATP將很快被分解掉[14]。因此，檢測ATP的濃度就可推出微生物的數(shù)量。生物發(fā)光法不需要培養(yǎng)微生物，而且熒光分光光度計(jì)是便攜式的，操作簡單，更適合現(xiàn)場測試，在幾分鐘內(nèi)可檢測出結(jié)果，因此ATP生物發(fā)光法已被用于食品安全的快速檢測，同時(shí)，該技術(shù)也被廣泛用在HACCP體系中關(guān)鍵控制點(diǎn)的檢測。

ATP生物發(fā)光技術(shù)現(xiàn)已多用于肉及肉制品雜菌污染的測定、飲料中微生物的測定[15]等。目前在歐美等國家，自動ATP生物發(fā)光技術(shù)已廣泛應(yīng)用于原奶產(chǎn)業(yè)中的活菌數(shù)檢測、UHT奶的活菌數(shù)檢測、設(shè)備的清潔度評價(jià)以及產(chǎn)品保質(zhì)期的計(jì)算等[16]。

3.2 微熱量計(jì)技術(shù)

微熱量計(jì)技術(shù)[17]主要利用細(xì)菌在不同繁殖階段時(shí)熱量的變化對細(xì)菌進(jìn)行檢測的一種新技術(shù)。由于不同的微生物代謝過程不同，產(chǎn)生的熱量就不同，測得的熱量曲線就不同，把記錄的各不相同的熱量曲線作為其特征“指紋圖”[18]，將實(shí)際測量的熱曲線與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖對比即可分離鑒別微生物。在實(shí)際生產(chǎn)中，利用該技術(shù)對牛奶生產(chǎn)中幾種常用的乳酸菌進(jìn)行微熱量研究，很快就可測得相應(yīng)細(xì)菌的“指紋圖”，因此與乳品檢測常規(guī)方法相比，該方法檢測更快速而且重現(xiàn)性更好[19]。

4 生物傳感器

生物傳感器主要利用生物化學(xué)和傳感技術(shù)，其基本組成為識別元件，信號轉(zhuǎn)換器和電子測量儀。其中識別元件主要有酶、抗體及細(xì)胞等。經(jīng)過一定處理后的樣品自由擴(kuò)散進(jìn)入識別元件，經(jīng)過特異性分子識別后與對應(yīng)元件發(fā)生結(jié)合，并產(chǎn)生生物學(xué)信號，之后經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換器將生物信號轉(zhuǎn)化為光信號或電信號，然后通過電子測量儀的放大和輸出，即可達(dá)到檢測目的[6]。

生物傳感器具有較多優(yōu)點(diǎn)，例如，具有較好的穩(wěn)定性，低成本，高選擇性，高靈敏度，可以在一個復(fù)雜的系統(tǒng)快速在線監(jiān)測和連續(xù)檢測大量樣品。Ercole[20]等研制出一種以電位交互為基礎(chǔ)的生物傳感器，其核心部件是轉(zhuǎn)換元件，采用一種以光尋址的電位傳感器。大腸桿菌在繁殖過程中會產(chǎn)生NH3，該生物傳感器主要通過檢測因氨氣的產(chǎn)生而導(dǎo)致的pH值的變化來檢測樣品中的大腸桿菌，相比傳統(tǒng)的菌落記數(shù)法，此方法更加靈敏、快速，可以在90min內(nèi)完成檢測，最低檢出限為10個/mL。

5 蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是由蛋白質(zhì)組學(xué)的興起而發(fā)展起來的一種新技術(shù)，該技術(shù)主要是通過構(gòu)建微生物蛋白特征指紋圖譜數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，使用專門的服務(wù)器和客戶端處理數(shù)據(jù)。經(jīng)簡單處理過的微生物菌落，使用專用質(zhì)譜儀，將獲得的質(zhì)譜圖直接輸入數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，與數(shù)據(jù)庫中收錄的已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，即可分析出目標(biāo)微生物的種類。

該方法具有很強(qiáng)的通用性，可以用來檢測多種微生物，而且樣品不需要進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶實(shí)驗(yàn)等，檢測速度更快更方便，且通量高。目前美國農(nóng)業(yè)部以及其他歐美高校及研究所等已將該技術(shù)應(yīng)用到了食源性致病菌微生物檢測及實(shí)際食品微生物檢驗(yàn)工作中[21-22]。

6 快速檢測方法的不足

通過以上對不同檢測技術(shù)的分析可知，不同的快速檢測技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢和最佳的使用范圍，很多的快速檢測技術(shù)具有食品專一性，對于一個特定的食品檢測性能最佳。但與此同時(shí)，許多檢測手段又在某些方面存在一定的局限性。比如，PCR及其衍生技術(shù)所需的儀器設(shè)備價(jià)格非常昂貴，非一般實(shí)驗(yàn)室能承受，所以限制了其在我國食品檢測領(lǐng)域的大面積推廣及應(yīng)用；基因芯片技術(shù)不僅儀器設(shè)備成本高，而且操作過程對實(shí)驗(yàn)人員的要求也比較高；很多檢測手段不能同時(shí)做到“定性”和“定量”分析；免疫學(xué)方法雖然速度較快、靈敏度也較高，但容易呈現(xiàn)假陽性、假陰性[23]。所以，現(xiàn)在有關(guān)食品微生物快速檢測亟待解決的問題主要是降低成本，提高自動化水平，降低對操作人員的要求與束縛，同時(shí)，最主要的問題是要提高檢測設(shè)備的靈敏度，增強(qiáng)對微生物的識別特異性，增強(qiáng)設(shè)備的通用性等。

7 展望

本文僅討論分析了眾多新型檢測技術(shù)中幾種較為常見的技術(shù)，還有許多新技術(shù)有待于進(jìn)一步學(xué)習(xí)與研究，如阻抗技術(shù)[24]、噬菌體鑒定技術(shù)、流式細(xì)胞儀（FCM）和固相細(xì)胞計(jì)數(shù)（SPC）法[25]等。隨著世界食品工業(yè)的高速發(fā)展，各國研究人員越來越重視強(qiáng)化食品質(zhì)量控制、加強(qiáng)衛(wèi)生檢驗(yàn)力度、提高應(yīng)急處理突發(fā)性食品安全事件的能力等，紛紛研究和建立快速檢測食品微生物的方法以滿足社會的需求。要保證食品安全生產(chǎn)、流通，就需要建立更有效、更靈敏、更快速的微生物檢測技術(shù)。相信隨著各個學(xué)科的不斷發(fā)展，學(xué)科之間的交融不斷深入，以及越來越多的新型快速檢測技術(shù)的出現(xiàn)，可以滿足食品安全等方面的各種不同的需求。預(yù)期在不遠(yuǎn)的將來，會出現(xiàn)更多的新型快速檢測技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)及生活中，能更好地為人類食品公共衛(wèi)生提供保障。

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Development Situation on Rapid Detection of Food Microorganism

YAO Song-ping1，YAN Rong1，YANG Shao-hua1，PENG Jin-jin2，LIU Guo-qing1，*
（1.Department of Chemical and Food Processing，Hefei University of Technology，Hefei230009，Anhui，China；2.Animal Science Department，Sanxia Vocational College of Chongqing，Chongqing404155，China）

With the rapid development of food industry，food safety accidents occur frequently.Therefore，food safety is being concerned by increasing consumers.Furthermore，there are many factors influencing the problem of food safety.Of these，food spoilage cause by microorganism may be amain factor.How to detect the microorganisms rapidly in food is still a hot research topic.Thus，several advanced detection technologies were summarized.Compared with the traditional detection methods，these methods were more convenient，faster and more sensitive.

microorganism；rapid detection；food safety

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.045

2016-05-31

安微省重大科技項(xiàng)目（07010301017）；大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201510359079）

姚松坪（1994—），男（漢），在讀本科生，食品質(zhì)量與安全專業(yè)。

*通信作者：劉國慶（1963—），男，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物化工研究。