羅慧玉，徐鵬，*，閆偉偉，陳建華

（1.張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北張家口075000；2.宣化鋼鐵公司職工醫(yī)院，河北張家口075100）

改進(jìn)MSPD-HPLC法快速檢測豬血豆腐中鎮(zhèn)靜劑及雌激素殘留

羅慧玉1，徐鵬1，*，閆偉偉1，陳建華2

（1.張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北張家口075000；2.宣化鋼鐵公司職工醫(yī)院，河北張家口075100）

建立改進(jìn)了的基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）-高效液相色譜法（HPLC/UVD）同時快速檢測豬血豆腐中的4種鎮(zhèn)靜劑（艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮和地西泮）及己烯雌酚殘留的方法。樣品以無水硫酸鈉和弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）為分散劑和凈化劑，甲醇為溶劑。色譜條件：C18色譜柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.），甲醇-乙腈-水（體積比30∶30∶40）為流動相，流速：1.0mL/min，檢測波長235 nm，柱溫：30℃。5組分在0.010μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 2。豬血豆腐中4種鎮(zhèn)靜劑的方法檢出限均為10 ng/g，己烯雌酚的方法檢出限為15 ng/g；5組分平均回收率在82.4%～104.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～3.5%。結(jié)果表明該方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，適用于豬血豆腐中己烯雌酚及多種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的快速檢測。

基質(zhì)固相分散萃??；高效液相色譜法；豬血豆腐；鎮(zhèn)靜劑；雌激素

鎮(zhèn)靜劑類藥物（Sedatives）對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的抑制作用，可以減輕或消除動物狂躁不安，該類藥物除具有鎮(zhèn)靜作為外，很多還是生長促進(jìn)劑，具有使動物嗜睡少動，生長快速、改變?nèi)赓|(zhì)的作用。另外，在動物運(yùn)輸過程中使用該類藥物，可減少動物體重下降和死亡，還可防止動物肉的品質(zhì)降低。近年來，一些不法商販在動物飼養(yǎng)和運(yùn)輸過程中擅自非法添加使用這些藥物，使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免的殘留于動物源食品中，造成食品安全隱患，進(jìn)而對人體健康造成不良影響。己烯雌酚是一種人工合成非甾體類雌激素，能夠促進(jìn)家畜的生長，長期食用含己烯雌酚的食品易致兒童性早熟、男性生殖系統(tǒng)異常，女性易發(fā)生乳腺癌等[1]。我國農(nóng)業(yè)部第176號公告規(guī)定嚴(yán)禁在動物飼料和飲用水中使用這兩類藥物，在動物源食品中不得檢出。

目前，檢測鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法有：液相色譜法（HPLC）[2]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/ MS）[3-4]，氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）[5]等。檢測雌激素類藥物的方法有：高效液相色譜法測定（HPLC）[6]，氣相色譜法[7]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[8]，酶聯(lián)免疫檢測法[9]等。HPLC-MS/MS和GC-MS方法具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但儀器價格昂貴，普及范圍受到限制。

基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）是由Barker等[10]首次提出的一種樣品處理技術(shù)。MSPD法是將常規(guī)的固相分散技術(shù)與反向鍵合填料相結(jié)合，使得組織勻漿、提取和凈化能夠在同一操作中完成。我們對該方法做了進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)，省略了溶解、裝填柱子、洗脫等步驟，處理步驟大為減少、方法操作更為簡化，結(jié)合高效液相色譜，對豬血豆腐中4種鎮(zhèn)靜劑艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、氯氮及雌激素己烯雌酚進(jìn)行了快速分析測定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC 2010A HT高效液相色譜儀、LC-2010HT紫外檢測器、SPD-M10A VP二極管陣列檢測器：島津公司；LC-Solution色譜工作站；YF-103型粉碎機(jī)：瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；XH-D渦旋混合器：江蘇天翎儀器有限公司；800型電動離心機(jī)：江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；KL512J型水浴氮吹儀：北京康林科技有限責(zé)任公司；Milli-Q Integral純水/超純水機(jī)：美國Millipore公司。

艾司唑侖（批號：1219-0102）、阿普唑侖（批號：171218-200603）、氯氮（批號：171248-200301）、地西泮（批號：171225-200302）、己烯雌酚（批號：100033-200607，含量：99.9%）：購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純；所用水為超純水；其余試劑均為分析純；豬血豆腐：購自超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.2 色譜條件

色譜柱：YMCC18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.）；柱溫：30℃；流動相∶甲醇-乙腈-水（30∶30∶40）；流速：1.0mL/min；檢測波長：235 nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.3 樣品處理

稱取勻漿好的豬血豆腐樣品1.0 g于研缽中，加入4.0 g混合分散劑[無水硫酸鈉∶弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）]，充分研磨至表面無殘余水分；將研磨好的樣品轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，加入10mL甲醇，渦旋震蕩1min，離心，取上清液；殘?jiān)迫肷鲜鼍呷瞧恐?，再?mL甲醇分兩次加入到三角瓶中同法進(jìn)行萃?。看?mL）；將3次萃取所得上清液合并后用氮吹濃縮至5.0mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后取10μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)采用甲醇-乙腈-水作為流動相，考察了不同體積比對各組分的保留時間和分離情況，結(jié)果表明甲醇-乙腈-水體積比為30∶30∶40時，艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、己烯雌酚、地西泮5組分能完全分開，峰型較好，保留時間相對較短。因此本試驗(yàn)采用體積比為30∶30∶40的甲醇-乙腈-水體系作為流動相。標(biāo)準(zhǔn)物譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution

2.2 分散劑種類及用量的選擇

在基質(zhì)固相分散樣品處理方法中，分散劑多為各類吸附劑，如硅膠、氧化鋁、弗洛里西土等，試驗(yàn)考察了不同的分散劑。當(dāng)分散劑全部為弗洛里西土?xí)r，樣品水分殘留過多，我們提出向分散劑中加入無水硫酸鈉，無水硫酸鈉能夠很好地吸收樣品中的水分，同時破壞樣品組織。試驗(yàn)考察了不同比例的無水硫酸鈉與弗洛里西土混合分散劑對試驗(yàn)效果的影響，當(dāng)無水硫酸鈉與弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）作為分散劑時，既能很好的吸附樣品中的水分，同時又能對樣品有一定的凈化作用。試驗(yàn)考察了混合分散劑用量為1.0 g～6.0 g時對試驗(yàn)效果的影響。經(jīng)比較當(dāng)樣品與混合分散劑為1∶3以下時，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，當(dāng)所加混合分散劑為4.0 g時，豬血豆腐中的水分被完全吸收、分散效果良好且樣品得到很好的凈化。如圖2所示。

圖2 樣品與分散劑比例對萃取效果的影響Fig.2 The influence of the samples and dispersant quality ratio over the extraction effect

2.3 萃取劑用量的選擇

5種待測物在甲醇中溶解性良好，且只作為極性溶劑的甲醇不易把樣品中的非極性干擾物萃取出來，故選用甲醇作萃取劑。萃取劑體積對萃取效果的影響如圖3所示。

圖3 萃取劑體積對萃取效果的影響Fig.3 The influence of extractant volume over the extraction effect

考察了不同萃取劑體積對試驗(yàn)效果的影響，樣品為1.0 g時，萃取體積在10mL～18mL，隨著溶劑體積加大，各組分峰面積值增大，當(dāng)萃取體積超過16mL時，各組分峰面積值趨于平緩或下降，故選擇16mL為最佳萃取體積。

2.4 萃取次數(shù)的選擇

在萃取劑體積相同的條件下，萃取次數(shù)會直接影響樣品回收率。萃取次數(shù)對萃取效果的影響如表1所示。

表1 萃取次數(shù)對萃取效果的影響Table1 The influence of extractant times over the extraction effect

試驗(yàn)同時考察了萃取劑總體積為16mL時，不同萃取次數(shù)對萃取效果的影響，結(jié)果顯示當(dāng)萃取次數(shù)為3次時，各組分回收率達(dá)到82.4%～104.4%。

2.5 線性方程、檢出限和定量限

各成分線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 線性方程和檢出限Table2 Linearity and detection limits

移取儲備液逐級稀釋，配成一系列濃度的混合工作溶液，在所選的色譜條件下，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制工作曲線，5種化合物在0.010μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 2。

在樣品測定的色譜條件下，以3倍信噪比確定各成分的最低檢出限：艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮為0.01μg/g，己烯雌酚為0.015μg/g；以10倍信噪比確定各成分的定量限：艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮為0.033μg/g，己烯雌酚為0.05μg/g。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

取1.0 g市售豬血豆腐6份，按1μg/g的加標(biāo)水平，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按2.1～2.4優(yōu)化后的方法處理樣品。在最優(yōu)化的色譜條件下平行測定，樣品加標(biāo)色譜圖見圖4，根據(jù)樣品液的本底值和加標(biāo)值，計(jì)算相應(yīng)的回收率，如表3所示。

圖4 加標(biāo)樣品色譜圖Fig.4 THE chromatograms of add sample

表3 樣品加標(biāo)回收率與精密度（n=6）Table3 The recoveries and precision（n=6）

由表3可知，5種化合物平均回收率在82.4%～104.4%之間，RSD為1.7%～3.5%（n=6），結(jié)果表明該方法具有較高準(zhǔn)確度及精密度。

2.7 樣品測定

采用本文建立的方法，對隨機(jī)購買的3份市售豬血豆腐用最優(yōu)的樣品前處理方法進(jìn)行處理，并在最優(yōu)的色譜條件下重復(fù)測定每個樣品3次。5種待測物質(zhì)均未被檢出。樣品色譜圖見圖5。

3 結(jié)論

圖5 實(shí)際樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the real sample

采用改進(jìn)了的MSPD法對豬血豆腐中的4種鎮(zhèn)靜劑（艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮）及己烯雌酚殘留進(jìn)行樣品前處理，該方法與傳統(tǒng)基質(zhì)固相分散萃取方法相比，省去了裝填柱子的過程，儀器設(shè)備簡單經(jīng)濟(jì)，同時采用混合分散劑不僅對樣品進(jìn)行了凈化同時也可吸收了樣品中的水分；該方法省時快速，步驟操作簡單，有機(jī)溶劑使用量少；提取凈化效率高、回收率、精密度較好，并結(jié)合采用高效液相色譜-紫外檢測器檢測，完全滿足了試驗(yàn)靈敏度要求，可對豬血豆腐樣品中的艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮及己烯雌酚殘留同時進(jìn)行快速檢測。

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Determination of Estrogen and Sedatives in Pig Blood Tofu Using Modified MSPD-HPLC Spectrometry

LUO Hui-yu1，XU Peng1，*，YAN Wei-wei1，CHEN Jian-hua2
（1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；2.Xuanhua Iron and Steel Company Worker Hospital，Xuanhua075100，Zhangjiakou，China）

A method was established for the separation and determination of diethylstilbestrol and four sedatives（estazolam，alprazolam，chlordiazepoxide and diazepam）in pig blood tofu by modified solid-phase dispersive extraction with high performance liquid chromatography.The anhydrous sodium sulfate and florisil（the ratio of quality 4∶1）was the dispersing agent and clean-up reagent in the process of modified solid-phase dispersive extraction.The methanol was chose as the solvent.The estrogen and sedatives were separated on C18column（5μm，250mm×4.6mm i.d.）employing methanol∶acetonitrile∶water=30∶30∶40 as mobile phase and determined using UV detector at 235 nm.The column temperature was 30℃.The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min.The linearity was good in the range of 0.010μg/mL-10μg/mL with the correlation coefficients above than 0.999 2.The limit of detection of sedatives was 10 ng/g and the limit of detection of diethylstilbestrol was15 ng/g The average recoveries of estrogen were 82.4%to 104.5%.The relative standard deviations were 1.7%-3.5%.The method is simple，quick and inexpensive，which was available for the detection of diethylstilbestrol and sedatives in pig blood tofu.

MSPD；HPLC；pig blood tofu；narcotic；estrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.032

2016-04-19

羅慧玉（1984—），女（漢），主管藥師，大學(xué)本科，主要從事食品安全檢測。

*通信作者：徐鵬，男，主管藥師，碩士，主要從事食品安全檢測。