姜隨意，吳業(yè)賓，王浩，寧保安，白家磊，彭媛，高志賢，*

（1.解放軍61251部隊衛(wèi)生隊，河北秦皇島066102；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所天津市環(huán)境與食品安全風險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室，天津300050）

用于組胺檢測的新型電化學(xué)傳感技術(shù)研究

姜隨意1，吳業(yè)賓1，王浩1，寧保安2，白家磊2，彭媛2，高志賢2，*

（1.解放軍61251部隊衛(wèi)生隊，河北秦皇島066102；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所天津市環(huán)境與食品安全風險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室，天津300050）

通過對檢測條件的優(yōu)化，制備高特異性、高穩(wěn)定性、高敏感的MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器，建立新型的組胺檢測方法。通過對該傳感器的電極電化學(xué)行為進行研究，分析出了電極電化學(xué)行為的變化規(guī)律，還對AuNPs的信號放大作用進行了驗證。該方法的檢測時間＜30min，標準曲線為：Y=2.953 lg X+1.968，R2=0.998 8，最低檢測限（LOD）：0.22 ng/mL，檢測范圍：0.25 ng/mL～100 ng/mL。以豆腐乳作為實際樣品進行加標回收試驗，加標回收率位于93.57%～103.93%之間，相對標準偏差（RSD）位于0.93%～3.08%之間，各檢測水平之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

組胺；電化學(xué)傳感技術(shù)；分子印跡膜；AuNPs信號放大

組胺是一種生物胺，有毒性，食品的腐敗變質(zhì)會產(chǎn)生大量的組胺[1-3]，組胺的檢測方法很多，但大多數(shù)方法都較為復(fù)雜、費時、費力，而且檢測靈敏度、檢測范圍還可以進一步提高[4-6]，為了進一步簡化操作程序、節(jié)約檢測時間、提高檢測靈敏度和擴大檢測范圍，我們建立了新型的MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感技術(shù)用于檢測組胺。

該傳感器是將電化學(xué)傳感技術(shù)、納米材料制備技術(shù)與MIP材料制備技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建的電化學(xué)傳感器，首先在玻碳電極上電化學(xué)沉積AuNPs起到信號放大作用，更重要的是還可以共價修飾引發(fā)劑AIBA，然后以組胺作為模板分子制備MIP膜，建立的MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器可以進行信號放大用于檢測組胺，該方法檢測組胺具有檢測范圍寬、靈敏度高、操作步驟簡單等優(yōu)點，經(jīng)反復(fù)再生后仍能多次重復(fù)地使用，應(yīng)用該傳感器我們成功地實現(xiàn)了對實樣中的組胺進行檢測，取得比較理想的效果，該傳感技術(shù)在食品安全的應(yīng)用具有很大的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（1g/100mL）：美國Sigma-Aldrich公司；鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]·3H2O）：天津贏達稀貴化學(xué)試劑廠；11-巰基十一烷酸（MUA）、甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、組胺標準品（Histamine）、2，2-偶氮雙（2-甲基丙脒）鹽酸鹽（AIBA）：美國Sigma–Aldrich公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：阿拉丁試劑上海有限公司；結(jié)構(gòu)類似物組胺酸、5-羥色胺、5-羥基吲哚乙酸、1-咪唑乙酸：百靈威科技有限公司；其它所有試劑均為國產(chǎn)分析純；試驗用水為天津衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所軍隊衛(wèi)生檢驗學(xué)研究室自制18.3MΩ·cm超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

電化學(xué)工作站：荷蘭IVIUM TECHNOLOGIES BV公司；Ag/AgCl電極（飽和KCl，參比電極）、鉑片電極（對電極）：上海辰華儀器有限公司；玻碳電極、金電極（直徑3mm，工作電極）：天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司；AL-204分析天平：美國METTLER TOLEDO；PB-10-pH計：德國Sartorius集團；Quanta 200FEG場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡：美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 玻碳電極的處理

取少量Al2O3粉置于麂皮上，加少量超純水潤濕，將清洗干凈的玻碳電極在麂皮上“8”字形打磨50次，然后輕微的轉(zhuǎn)動方向繼續(xù)“8”字形打磨，需多次轉(zhuǎn)動方向打磨，玻碳電極打磨光滑后，用ddH2O、無水乙醇沖洗，然后連接三電極體系（工作電極：玻碳電極；參比電極：Ag/AgCl電極；對電極：鉑片電極），對玻碳電極在電解液（5.0 mmol/L的K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]和0.1mol/LKCl的磷酸鹽緩沖液，使用前N2除10min）中進行循環(huán)伏安法（CV）表征，掃描電位：-0.3V～0.8V，掃描速率：100mV/s，直至出現(xiàn)清晰的氧化還原峰，產(chǎn)生的氧化還原峰電位差小于100 mV，該電極才能達到試驗標準，才能進行下一步試驗，否則需要重復(fù)打磨電極[7]。

1.3.2 MIP-AuNPs-GCE的制備

將打磨好的玻碳電極浸泡在密封的0.5 g/L的氯金酸水溶液中（18.3MΩ·cm超純水配制），連接好電極，在-0.2V的恒電位下連續(xù)地掃描200 s，使被還原的AuNPs沉積在電極表面，無水乙醇、ddH2O依次沖洗干凈，然后在新配制的Piranha溶液中浸泡5min，再用ddH2O仔細沖洗，氮氣吹干備用[8]。

將上述電極在1 mmol/L MUA乙醇溶液中反應(yīng)12 h，用無水乙醇、ddH2O依次沖洗干凈，然后在400mmol/LEDC和100mmol/LNHS混合液（1∶1，體積比）中，采用避光振蕩的方式活化1 h，再將電極放入200mmol/LAIBA水溶液中反應(yīng)3 h，反應(yīng)完畢后，將制備的電極置入含有MAA（0.4 mmol）、EGDMA（0.8 mmol）、組胺（0.2mmol）、DMSO（5mL）的預(yù)聚合液中（置入電極前，先超聲除氧10min），N2除氧10min后，迅速封閉容器，60℃反應(yīng)16 h。待聚合反應(yīng)完畢后，用甲醇∶冰乙酸=9∶1（體積比）混合液洗脫模板分子4次，每次40min，然后再用甲醇溶液洗脫模板分子2次，最后用無水乙醇、ddH2O沖洗干凈，氮氣吹干備用。不加模板分子，按同樣方法制備NIP膜。MIPAuNPs-GCE傳感器的構(gòu)建圖見圖1。

圖1 MIP-AuNPs-GCE傳感器的構(gòu)建圖Fig.1 The construction diagram of the MIP-AuNPs-GCE electrochemical sensor

1.4 試驗條件的優(yōu)化

1.4.1 最佳pH值的篩選

本試驗對傳感器檢測組胺的pH值進行了優(yōu)化，具體方法如下：將1.0 ng/mL組胺溶液的pH值分別調(diào)到4～12，再將制備好的電極分別孵育10min，然后進行EIS法表征，每個水平檢測3次，觀察pH值對電阻抗變化（ΔZ＇）的影響。

1.4.2 孵育時間的優(yōu)化

將制備好的電極在1.0 ng/mL組胺溶液中孵育，每隔1min進行EIS法表征，待電阻抗變化（ΔZ＇）不再隨時間的變化而改變，說明電極對組胺分子的吸附已達到飽和，每個水平檢測3次，記錄數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 電化學(xué)傳感器的表征

應(yīng)用Quanta 200FEG掃描電子顯微鏡（SEM）對電極表面的修飾物進行表征，然后對結(jié)果進行分析。

應(yīng)用電化學(xué)阻抗譜法（EIS）對電極進行表征，試驗首先確定組胺的檢測范圍，用制備好的電極分別檢測不同濃度梯度的組胺標準液（0.25、0.5、1.0、5.0、10、50、100 ng/mL），每個濃度測量3次，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪制響應(yīng)曲線及標準曲線，計算組胺的檢測限值（LOD）。試驗是在5.0mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]和0.1mol/L KCl的磷酸鹽緩沖液中進行的，掃描電位：-0.3 V～0.8 V，掃描速率：100mV/s，檢測時間約7min。

1.6 精密度試驗

對1.0 ng/mL組胺溶液進行EIS表征，對同一電極洗脫和再生8次后進行重復(fù)檢測，觀察電阻抗變化，再取5支規(guī)格完全相同的電極按相同的方法制備MIP膜檢測組胺溶液，評估該傳感器的精密度，檢驗傳感器的重復(fù)性、穩(wěn)定性和再生性。

1.7 特異性分析

取10倍濃度的組胺結(jié)構(gòu)類似物分別用修飾MIP膜、NIP膜的電極進行檢測，評估MIP膜對組胺檢測的特異性。

1.8 實樣的制備及加標回收試驗

為了對制備的傳感器進行驗證，以豆腐乳（購自本地超市）作為實樣加標組胺進行檢測，試驗前先對樣品前處理提取組胺，方法如下：取10 g樣品加入含90mLPBS萃取瓶中，振蕩20 s，靜置5min，重復(fù)此操作2次，然后在4℃離心5min，過濾后制備得到原液，PBS稀釋1 000倍，存放4℃?zhèn)溆?。用提取液制?.0、5.0、10 ng/mL的組胺溶液進行加標回收試驗，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)計算加標回收率及相對標準偏差（RSD）。

1.9 數(shù)據(jù)的分析和處理

本試驗用OriginPro8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行了分析和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP-AuNPs-GCE的表征

將不同修飾狀態(tài)下的玻碳電極用SEM表征見圖2。

圖2 不同修飾狀態(tài)下的玻碳電極SEM表征圖Fig.2 SEM images of the GCE with different modified states

從圖2 A可以看出，電極上緊密排列的AuNPs清晰可見，結(jié)構(gòu)均一；圖2 B中可見大量的蜂窩結(jié)構(gòu)，在AuNPs上制備MIP膜后，電極表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其形貌有著明顯的差異。

2.2 AuNPs的信號放大作用及檢測范圍的確定

將相同試驗條件下構(gòu)建的MIP-AuNPs-GCE與MIP-Au分別對不同濃度組胺進行檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同修飾的電極檢測不同濃度組胺的電阻抗變化圖Fig.3 The sensor response of the different modified electrodes in different concentrations of histamine

MIP-Au檢測范圍更窄，靈敏度更低，AuNPs-MIP-GCE具有較明顯的信號放大作用，此時組胺濃度在0.25 ng/mL～100 ng/mL呈線性關(guān)系，故將組胺的檢測范圍定為：0.25 ng/mL～100 ng/mL。

2.3 電極電化學(xué)行為的研究

分別應(yīng)用CV法和EIS法對不同修飾狀態(tài)下的電極進行表征如圖4所示。

圖4（a）在玻碳電極表面電化學(xué)沉積AuNPs后，電子轉(zhuǎn)移明顯加快，氧化還原峰明顯增高，信號具有明顯放大作用，在AuNPs-GCE上制備MIP膜后，洗脫模板分子前，MIP-AuNPs-GCE與NIP-AuNPs-GCE的CV曲線相似，氧化還原峰都很低平，在洗脫模板分子后，MIP-AuNPs-GCE的CV曲線再次出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，但其電流小于裸電極的電流，而NIP-AuNPs-GCE未見明顯變化。原理在于洗脫模板分子組胺后，MIP-AuNPs-GCE暴露出大量的印跡孔穴，電解液能經(jīng)過孔穴直接與部分AuNPs-GCE接觸，致使電子轉(zhuǎn)移的阻力減小，電流增大，可以再次出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，而NIP膜沒有孔穴暴露。圖4（b）應(yīng)用EIS法對電極進行表征，EIS曲線前面的半圓直徑表示電子轉(zhuǎn)移的電極表面電阻，試驗效果同CV法。

圖4 玻碳電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)表征圖Fig.4 Electrochemical characterization of the GCE with different modified states

2.4 試驗條件的優(yōu)化

2.4.1 最佳pH值的選擇

pH值對MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器檢測組胺的影響見圖5。

圖5 pH值對MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器檢測組胺的影響Fig.5 The MIP-AuNPs-GCE sensor detected histamine in varying pH conditions

該電化學(xué)傳感器的性能依賴檢測環(huán)境的pH值，pH值的變化對傳感器影響較大，直接影響傳感器的電化學(xué)表征，檢測組胺時必須對pH值進行優(yōu)化。由于組胺在不同的pH值形態(tài)會發(fā)生較大的變化，將1.0 ng/mL組胺溶液的pH值分別調(diào)到4～12與MIP-AuNPs-GCE孵育，然后進行EIS法表征，當pH值在7～9之間時，電阻抗的變化明顯大于其它pH值，而當pH值位于8時，該傳感器達到最佳檢測效果。

2.4.2 孵育時間的優(yōu)化

本研究還對電極孵育時間進行了優(yōu)化，設(shè)定孵育時間范圍為：1min～15min，通過對組胺的檢測研究孵育時間與電阻抗變化（ΔZ＇）的關(guān)系，檢測結(jié)果如圖6所示。

圖6 孵育時間對MIP-AuNPs-GCE傳感器響應(yīng)信號的影響Fig.6 Effect of incubation time on the MIP-AuNPs-GCE sensor

孵育時間從開始的1min增加至10min時，電極的電阻抗變化（ΔZ＇）呈逐漸上升趨勢，在孵育10min之后曲線變得平穩(wěn)，未見明顯波動，可認為在孵育10 min后電極對組胺的吸附達到飽和狀態(tài)，故本試驗將最佳孵育時間設(shè)定為10min。

2.5 吸附響應(yīng)試驗及標準曲線的建立

應(yīng)用EIS法對不同濃度的組胺進行表征，如圖7所示。

圖7 EIS對不同濃度組胺的表征圖Fig.7 EIS characterization of different concentrations of histamine

可見各個濃度組胺對應(yīng)的EIS響應(yīng)信號成梯度變化。根據(jù)EIS響應(yīng)信號變化，通過OriginPro8.0軟件繪制出劑量響應(yīng)曲線和標準曲線，見圖8。

繪制的劑量響應(yīng)曲線是一個典型的等溫結(jié)合反應(yīng)曲線，該曲線的初始信號上升激烈，而后逐漸出現(xiàn)飽和平穩(wěn)，將組胺濃度進行對數(shù)變換，繪制出標準曲線：Y=2.953 lg X+1.968，R2=0.998 8，根據(jù)三倍的信噪比（S/N=3）計算出檢測限值：0.22 ng/mL。

圖8 MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器檢測組胺的響應(yīng)曲線及標準曲線Fig.8 Response curve and calibration curve of the MIP-AuNPs-GCE sensor for histamine

2.6 精密度試驗

應(yīng)用制備的玻碳電極對組胺溶液進行電化學(xué)表征，選用1.0 ng/mL組胺的原因在于當組胺濃度為該值時，響應(yīng)曲線的電阻抗變化位于曲線的陡直階段，當組胺的濃度稍微發(fā)生變化，電阻抗的變化就會發(fā)生較顯著的改變，要想得到較一致的響應(yīng)信號，必然對傳感器的靈敏度要求很高，因此選用1.0 ng/mL組胺進行精密度實驗?zāi)軌蚋玫姆磻?yīng)出傳感器的靈敏度。用同一電極重復(fù)檢測組胺8次，電阻抗的變化（ΔZ'）一致性較好，相對標準偏差（RSD）為1.82%，應(yīng)用制備條件完全相同的5根玻碳電極分別對該濃度組胺進行檢測，電極電阻抗變化的RSD為4.21%，均表明構(gòu)建的傳感器穩(wěn)定度好、精密度高。

2.7 特異性分析

分別用MIP膜、NIP膜修飾的玻碳電極檢測不同濃度的組胺溶液，每個濃度檢測3次，比較結(jié)果如圖9所示。

圖9 MIP膜與NIP膜對組胺檢測的選擇性比較Fig.9 Selectivity comparison of MIP film and NIP film for histamine

MIP膜對組胺的吸附作用要明顯好于NIP膜，可以認為制備的MIP膜對組胺有良好的選擇性。再應(yīng)用制備的電極分別對組胺及10倍濃度的結(jié)構(gòu)類似物進行檢測，結(jié)果如圖10所示。

圖10 組胺與結(jié)構(gòu)類似物的電阻抗變化的比較Fig.10 The impedance shift of histamine and structural analogues

均表明制備的MIP膜對組胺的特異性高、選擇性好，而MIP膜和NIP膜對組胺結(jié)構(gòu)類似物均無選擇性。2.8實際樣品應(yīng)用

為了研究MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器的實用性，本研究選擇組胺含量高的豆腐乳作為實際樣品進行檢測，在檢測之前先對樣品進行處理并提取組胺，對制備的提取液進行加標回收試驗，每個濃度測量3次，該傳感器的加標回收率在93.57%～103.93%之間，其相對標準偏差（RSD）位于0.93%～3.08%之間，詳細結(jié)果見表1所示。

表1 以豆腐乳作為實際樣品應(yīng)用MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器檢測組胺的加標回收試驗（n=3）Table1 The content of histamine in fermented bean curd samples were detected by the senor using the spiked recoveries method（n=3）

3 結(jié)論

本研究首先將AuNPs電沉積在打磨好的玻碳電極表面，然后在電極表面的AuNPs上共價接枝引發(fā)劑，再聚合制備能夠特異性識別組胺的MIP膜，洗脫模板分子組胺，制備得到大量的印跡孔穴，其功能結(jié)構(gòu)與模板分子互補，能與組胺分子發(fā)生特異性結(jié)合，從而建立能夠檢測組胺的MIP-AuNPs-GCE電化學(xué)傳感器。當MIP膜上的印跡孔穴特異性識別組胺分子后，該傳感器的表征信號會發(fā)生變化，可以得到組胺濃度變化與電化學(xué)響應(yīng)信號變化的關(guān)系。經(jīng)過對MIPAuNPs-GCE電化學(xué)傳感器的選擇性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和再生性分析，試驗結(jié)果表明該傳感器對組胺結(jié)構(gòu)類似物無明顯的交叉反應(yīng)，具有極好的重復(fù)使用性能和極好的穩(wěn)定性。用豆腐乳進行實樣檢測和加標回收試驗，檢測效果好，具有很好的發(fā)展前景。

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New-style Electrochemical Sensors for the Detection of Histamine

JIANG Sui-yi1，WU Ye-bin1，WANG Hao1，NING Bao-an2，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，GAO Zhi-xian2，*
（1.61251 Troops Medical Team of PLA，Qinhuangdao 066102，Hebei，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Institute of Health and Environmental Medicine，AMMS，Tianjin 300050，China）

By the optimization of the experimental conditions，a MIP-AuNPs-GCE electrochemical sensor was established which had a very good specificity，stability，and selectivity for histamine detection.The electrochemical behaviors of the electrode were studied and its change regulation was obtained.The signal amplification effect of AuNPs was also verified.Electrochemical measurements were performed via electrochemical impedance spectroscopy（EIS）and the calibration curve obtained.The calibration curve formula was Y=2.953 lg X+1.968（R2= 0.998 8）.The minimum detection limit of the established method was0.22 ng/mL.The sensing technique allows for the detection of histamine in the wide range from 0.25 ng/mL to 100 ng/mL and detection time less than 30 min.The content of histamine in fermented bean curd samples were also detected using the spiked recoveries method.The determination results indicated good recoveries，ranging from 93.57%to 103.93%，with relative standard deviation（RSD）of0.93%to3.08%.The detection results had a good statistical significance.

histamine；electrochemical sensing technology；molecularly imprinted polymer（MIP）films；AuNPs signal amplification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.024

2016-05-19

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2013YQ140371）；國家自然科學(xué)基金青年項目（21207161）；天津市科技支撐計劃（14ZCZDSF00021）

姜隨意（1982—），男（漢），醫(yī)師，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通信作者：高志賢（1966—），男（漢），研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。