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        子宮腺肌病患者子宮結(jié)合帶組織中OTR、PKCβ、CPI-17表達觀察

        2017-03-13 07:02:34劉燕孔紅霞周俊杰陳雁南楊立王玉霞鄭州大學第三附屬醫(yī)院鄭州450052
        山東醫(yī)藥 2017年7期
        關(guān)鍵詞:蛋白激酶平滑肌肌層

        劉燕,孔紅霞 ,周俊杰,陳雁南,楊立,王玉霞(鄭州大學第三附屬醫(yī)院,鄭州450052)

        子宮腺肌病患者子宮結(jié)合帶組織中OTR、PKCβ、CPI-17表達觀察

        劉燕,孔紅霞 ,周俊杰,陳雁南,楊立,王玉霞
        (鄭州大學第三附屬醫(yī)院,鄭州450052)

        目的 觀察子宮腺肌病(AM)患者子宮結(jié)合帶(JZ)組織中縮宮素受體(OTR)、蛋白激酶Cβ(PKCβ)、蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17(CPI-17)蛋白及mRNA表達變化,并探討其意義。方法 選擇45例行子宮切除術(shù)的子宮腺肌病(AM)患者(AM組)及45例因?qū)m頸CINⅡ~Ⅲ或卵巢良性腫瘤行子宮切除的婦科患者(對照組)。兩組術(shù)中均留取子宮JZ組織。采用免疫組化法和實時熒光定量PCR法檢測兩組JZ區(qū)組織中OTR、PKCβ、CPI-17蛋白及mRNA。結(jié)果 AM組OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白的陽性表達率分別為77.8%(35/45)、84.4%(38/45)、71.1%(32/45)、82.2%(37/45),對照組分別為17.8%(8/45)、22.2%(10/45)、60.0%(27/45)、20.0%(9/45),AM組OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白的陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)。AM組JZ組織中OTR、PKCβ mRNA的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。AM患者JZ區(qū)組織中OTR與PKCβ蛋白表達呈正相關(guān)(r= 0.453,P<0.05 ),PKCβ蛋白與CPI-17蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.516,P<0.05 )。結(jié)論 OTR、PKCβ、CPI-17在AM患者JZ區(qū)組織中高表達,三者可能共同參與了AM的發(fā)生、發(fā)展。

        子宮腺肌??;子宮結(jié)合帶;縮宮素受體;蛋白激酶Cβ;蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17

        子宮腺肌病(AM)被定義為一種子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)入侵到子宮肌層的女性良性疾病[1,2]。AM發(fā)病機制目前尚不明確,隨著 MRI 等影像學檢查在婦科疾病中的應用,關(guān)于AM發(fā)病機制的研究最近聚焦于子宮結(jié)合帶(JZ)[3],JZ區(qū)是近年來定義的子宮內(nèi)膜與肌層交界處的內(nèi)層肌層結(jié)構(gòu), 在MRI上呈低信號強度。JZ區(qū)組織解剖結(jié)構(gòu)異常與 AM 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在正常的育齡期女性中,JZ帶在MRI上的厚度約2~8 mm,而JZ厚度>12 mm是臨床公認的診斷AM的閾值[4]。起源于JZ區(qū)的節(jié)律性收縮可維持子宮正常結(jié)構(gòu)和功能[5]。目前研究認為,AM的發(fā)生發(fā)展可能與JZ區(qū)的異常收縮有關(guān),但其具體機制目前尚未明確??s宮素受體(OTR)作為 G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員,參與調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮,蛋白激酶Cβ(PKCβ)可調(diào)控細胞生長、增生、分化、凋亡等多種信號通路,蛋白激酶C磷酸酶抑制蛋白17(CPI-17)是PKCβ的主要作用底物。目前關(guān)于OTR、PKCβ、CPI-17在AM發(fā)生、發(fā)展中作用的相關(guān)報道較少。2015年1~12月,我們觀察了AM患者JZ組織中OTR、PKCβ、CPI-17蛋白及mRNA表達變化,并探討其意義。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選擇我院2015年1月~2015年12月收治的子宮腺肌病(AM)患者45例(AM組),年齡34~55歲;病程2~10年,月經(jīng)周期規(guī)律,均行子宮切除術(shù),術(shù)后病理確診為AM,術(shù)中子宮體前壁靠近宮底處刮去內(nèi)膜,切取JZ區(qū)約1.5 cm×1 cm×0.2 cm組織2塊,固定后-80 ℃保存?zhèn)溆?。排除標?合并子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮粘膜下肌瘤、糖尿病、甲狀腺功能亢進、腎上腺功能亢進等疾病者;術(shù)前3個月使用激素治療及放置宮內(nèi)節(jié)育器者。另選擇45例因?qū)m頸CINⅡ~Ⅲ或卵巢良性腫瘤行子宮切除的婦科患者45例為對照組,年齡30~65歲;術(shù)中留取子宮JZ組織標本。全部標本取材均經(jīng)過本院倫理委員會批準,所有患者均知情同意。

        1.2 兩組JZ區(qū)組織OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白檢測 組織切除后甲醛固定,石蠟包埋,4 μm厚度切片。采用免疫組化二步反應法:脫蠟水化、抗原修復、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗,4 ℃孵育過夜,二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復染。以PBS代替一抗作陰性對照。參照文獻中的半定量方法綜合染色強度和陽性細胞百分率確定表達水平[6]。每張切片至少觀察5個高倍鏡下視野,鏡下細胞質(zhì)和(或)細胞膜顯示棕黃色或棕褐色判定細胞陽性。細胞染色無色計0分、輕度著色計1分、中度著色計2分、重度著色計3分; 陽性細胞百分比>50%計3分、26%~50%計2分、5%~25%計1分,<5%計0分;上述兩項分值的乘積≤3為陰性、>3為陽性[4]。

        1.3 兩組JZ區(qū)組織OTR、PKCβ、CPI-17 、CPI-17 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR技術(shù)按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,用紫外分光光度計測RNA濃度及純度,遵照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。OTR: 上游引物5′-ATGGGCTAACGGTTTGAATAG-3′,下游引物5′-CCTCACCGACACTCGTTCTT-3′;PKCβ:上游引物5′-ACCGCCTGTACTTTGTGATGGAGT-3′,下游引物5′-CCGATGGCAATTTCTGCAGCGTAA-3′;CPI-17上游引物5′-CAGACATGCCCGATGAGATCAACA-3′,下游引物5′-AAGTCCTCGACAGGTTTCCCACAT-3′;β-actin(內(nèi)參):上游引物5′-GCGGGAACTGCCTGACT-3′,下游引物5′-CTCGTTGCCGATGGTGAT-3′。以上引物均由上海生工科技公司合成。PCR反應體系: traSYBR Mixture 10 μL,上游、下游引物各0.8 μL,cDNA 1 μL,RNase-Free Water 7.4 μL,總反應體系為20 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸 1 min ,共40個循環(huán)。溶解曲線分析:95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,60 ℃、15 s。以2-ΔΔCt表示目的基因(OTR、PKC、CPI-17)的相對表達量[7]。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組JZ區(qū)組織中OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白表達比較 AM組OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白的陽性表達率分別為77.8%(35/45)、84.4%(38/45)、71.1%(32/45)、82.2%(37/45),對照組分別為17.8%(8/45)、22.2%(10/45)、60.0%(27/45)、20.0%(9/45),AM組OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白的陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)。

        2.2 兩組JZ區(qū)組織OTR、PKCβ、CPI-17 、CPI-17 mRNA相對表達量比較 AM組JZ組織中OTR、PKCβ mRNA的相對表達量均高于對照組(P均<0.05),CPI-17 mRNA的相對表達量高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

        表1 兩組JZ區(qū)組織OTR、PKCβ、CPI-17 、CPI-17 mRNA相對表達量比較±s)

        注:與對照組比較,#P<0.05。

        2.3 AM患者JZ區(qū)組織OTR、PKCβ、CPI-17 、CPI-17蛋白表達相關(guān)性分析 AM患者JZ區(qū)組織中OTR與PKCβ蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.453,P<0.05 ),PKCβ蛋白與CPI-17蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.516,P<0.05 )。

        3 討論

        AM是子宮內(nèi)膜及腺體突破JZ區(qū)侵入子宮肌層的疾病,因而JZ區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的異常是子宮腺肌病發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)[8,9]。Birnholz等[10]報道JZ區(qū)在非妊娠期存在周期性蠕動。這種周期性變化是JZ調(diào)控非妊娠期子宮收縮的物質(zhì)基礎(chǔ),使子宮收縮的方向、節(jié)律、強度與月經(jīng)周期同步,對維持正常月經(jīng)、精子輸送及受精卵種植等子宮正常生理功能起到至關(guān)重要的作用。對AM患者進行超聲監(jiān)測發(fā)現(xiàn)[11],AM患者的UC頻率增多,振幅增加。高分辨陰道超聲顯示子宮腺肌病子宮增大,子宮壁增厚,肌層不均質(zhì)回聲或者回聲中斷等,JZ區(qū)增厚≥12 mm。臨床通過MRI及HSSG顯示AM患者JZ區(qū)明顯增寬且存在非妊娠期異常收縮波[12]?;颊呓?jīng)血逆流的發(fā)生率和痛經(jīng)的程度和JZ區(qū)異常子宮收縮存在正相關(guān),AM患者存在JZ區(qū)蠕動亢進及節(jié)律紊亂,可能參與AM患者功血、痛經(jīng)及不孕等臨床癥狀的發(fā)生。

        OTR參與調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮不僅與平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān),而且與平滑肌收縮蛋白鈣敏化有關(guān)。“鈣敏化”的主要機制在于肌球蛋白輕鏈(MLC20)的磷酸化水平[13],而MLC20磷酸化水平受肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)活性比值的影響,MLCK可以催化MLC20的ser19位點磷酸化,引起MLC20磷酸化水平增高,使平滑肌對鈣敏感性增加, MLCP可以導致MLC20去磷酸化,使平滑肌松弛,當MLCP活性受抑制時,也會導致MLC20的磷酸化水平增高,使平滑肌對Ca2+的敏感性增加[14]。OTR作為 G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員,可與 G 蛋白耦聯(lián),激活磷脂酶 C,引起肌醇三磷酸(IP3)和二乙酰甘油(DAG)增加,IP3活化肌漿網(wǎng)特異性受體釋放 Ca2+至胞質(zhì)溶膠,可進一步引起細胞外 Ca2+內(nèi)流,使 MLC20磷酸化,引起平滑肌收縮;DAG可激活 PKC。有學者[14]研究表明,OTR可調(diào)節(jié)非孕期子宮平滑肌的收縮。PKCβ/CPI-17[15]通路是調(diào)節(jié)平滑肌收縮蛋白鈣敏化的重要機制。PKC 是一類磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在調(diào)控細胞生長、增生、分化、凋亡等多種信號通路中起重要調(diào)節(jié)作用。CPI-17是PKCβ的主要作用底物,人類CPI-17編碼基因位于染色體19q13.1,含3個內(nèi)含子和4個外顯子。廣泛表達于氣道、血管、胃腸道、子宮等多種平滑肌中,通過抑制MLCP的活性,是調(diào)節(jié)鈣敏感性的重要分子。而且磷酸化CPI-17對MLCP的抑制作用增強1 000倍。PKC激活后可通過誘導CPI-17磷酸化,其磷酸化后作為 MLCP 的假底物,結(jié)合于酶催化部位(PP1c),使MLCP失活。競爭性抑制 MLC20去磷酸化,使胞質(zhì)內(nèi)MLC20磷酸化水平升高,肌動-肌球蛋白交聯(lián)增加,促進肌動蛋白微絲骨架聚合,誘導平滑肌細胞收縮。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AM組OTR、PKCβ、CPI-17 及磷酸化CPI-17蛋白的陽性表達率均高于對照組。AM組JZ組織中OTR、PKCβ mRNA的相對表達量均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義,CPI-17 mRNA的相對表達量高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義。AM患者JZ區(qū)組織中OTR與PKCβ蛋白表達呈正相關(guān),PKCβ蛋白與CPI-17蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系。說明AM組JZ區(qū)中OTR可能通過首先激活PKCβ,PKCβ激活后可通過誘導CPI-17磷酸化而抑制MLCP活性,從而增加MLC20磷酸化水平及收縮蛋白對Ca2+敏感性,影響JZ區(qū)平滑肌的正常收縮。局部增多的OTR可能通過激活PKCβ/CPI-17信號通路導致JZ區(qū)的收縮異常,其子宮平滑肌的異常收縮可能導致內(nèi)膜基底層缺血缺氧而損傷,或異常舒張導致子宮壓力減少,宮腔壓力相對增加,子宮肌層形成縫隙,導致內(nèi)膜腺體及間質(zhì)細胞逆向生長異位于子宮平滑肌內(nèi),從而更好解釋基底內(nèi)膜內(nèi)陷學說。Nakai等[12]認為JZ區(qū)平滑肌蠕動亢進會使得局部自發(fā)形成機械性微損傷,導致內(nèi)膜碎片進入肌層生長,從組織損傷修復TIAR的角度支持了子宮異常收縮與AM發(fā)生的關(guān)系。JZ區(qū)結(jié)構(gòu)及功能的異常是AM臨床表現(xiàn)的病理生理基礎(chǔ)。研究表明患有AM的女性,不僅其JZ區(qū)明顯增厚,其子宮收縮的方向、頻率及幅度增強。這些觀察進一步說明JZ區(qū)異常蠕動在AM的發(fā)病機理中扮演不可或缺的角色。它可促進經(jīng)期經(jīng)血及有活性的子宮內(nèi)膜細胞逆流入腹腔,從而導致腹腔子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。總之,局部增多的OTR可能通過激活PKCβ/CPI-17信號通路增加Ca2+敏感性,從而影響JZ區(qū)的正常收縮,這一過程可能參與AM的發(fā)生、發(fā)展。

        綜上所述,OTR、PKCβ、CPI-17在AM患者JZ區(qū)組織中高表達,三者可能共同參與了AM的發(fā)生、發(fā)展。但其具體機制尚未明確,OTR 拮抗劑是否可以作為一種新藥來緩解AM的病情進展,尚需大樣本、多中心等進一步研究。

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        孔紅霞(E-mail: 15235537579@139.com)

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