于瑞冉,曾薇,單莉(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011)

·臨床研究·

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)變化及其意義

于瑞冉,曾薇,單莉
(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011)

目的 觀察食管鱗狀細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌)組織中磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(P-EGFR)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 100例食管鱗癌患者，手術(shù)治療中均留取癌組織(觀察組)和癌旁正常組織(對(duì)照組)，采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組組織中磷酸化EGFR(P-EGFR)，分析P-EGFR的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 觀察組癌組織中P-EGFR的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。P-EGFR的表達(dá)與食管鱗癌患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P均>0.05)。P-EGFR低表達(dá)者總生存期、無(wú)病生存期均長(zhǎng)于P-EGFR高表達(dá)者(P均<0.05)。多元Cox回歸分析結(jié)果表明P-EGFR高表達(dá)是影響食管鱗癌生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 食管鱗癌組織中P-EGFR高表達(dá)。P-EGFR高表達(dá)是影響食管鱗癌生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P-EGFR可能是一個(gè)預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

食管腫瘤；食管癌；食管鱗狀細(xì)胞癌；表皮生長(zhǎng)因子受體

食管鱗狀細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌)發(fā)病率位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第5位[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是多數(shù)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞增殖的重要途徑，參與細(xì)胞分化發(fā)育、細(xì)胞周期循環(huán)調(diào)控、細(xì)胞間功能同步等多種生理病理過(guò)程[2～4]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在許多腫瘤中被磷酸化激活，而激活的磷酸化EGFR(P-EGFR)具有酪氨酸激酶活性，能將一系列細(xì)胞外生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，是維持癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要條件[5，6]，并可能是肺癌、胃癌、大腸腺癌等腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷及靶向治療的可靠靶點(diǎn)。目前關(guān)于其在食管鱗癌中的研究報(bào)道較少。本研究觀察了食管鱗癌組織中P-EGFR的表達(dá)變化，分析其與食管鱗癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院自2006年1月～2009年12月收治的食管鱗癌患者100例，其中男71 例、女29例，年齡47～80(60.4±8.3)歲；術(shù)前均未接受放療、化療等其他抗腫瘤治療；腫瘤分級(jí)、TNM分期均采用2010年AJCC公布的最新標(biāo)準(zhǔn)(第七版)；手術(shù)中均留取癌組織(觀察組)和距離腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 兩組P-EGFR檢測(cè)方法 鼠抗人P-EGFR單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(sc-166260)；鼠/兔免疫組織化學(xué)試劑盒(HRP-anti-Rabbit/Mouse，Kit-9720)、蘇木素染色劑、DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組組織中P-EGFR，用正常鱗狀上皮組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)稍加改進(jìn)，具體如下：所有組織標(biāo)本固定、包埋，抗原修復(fù)，室溫下自然冷卻，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加過(guò)氧化物酶阻斷試劑，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min；除去血清，滴加鼠抗人P-EGFR抗體(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，3 min/次；除去PBS，切片上滴加新鮮配制的DAB試劑顯色；顯微鏡下觀察染色情況，及時(shí)自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。正常鱗狀上皮組織中，P-EGFR陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，基底細(xì)胞以及副基底細(xì)胞不表達(dá)或弱表達(dá)。隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(200×)，至少計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞的染色情況，分別按照細(xì)胞著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分比計(jì)分[5]：細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞≤5%計(jì)0分、5%～30%計(jì)1分、31%～60%計(jì)2分、≥60%計(jì)3分；上述兩項(xiàng)分值的和為樣本最后得分，0～3分表示P-EGFR低表達(dá)、4～6分表示P-EGFR高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P-EGFR表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等臨床病理參數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，并行Log-rank檢驗(yàn)；將單因素分析中P<0.05的因素進(jìn)行多因素分析。多因素分析采用Cox逐步回歸法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織P-EGFR表達(dá)比較 觀察組、對(duì)照組組織P-EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為64%(64/100)、12%(12/100)，兩組相比，P<0.05。

2.2 P-EGFR表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 單因素分析顯示，P-EGFR的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤直徑(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)、臨床分期(TNM分期)均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 P-EGFR表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 100例患者中共84例獲得隨訪，其中P-EGFR高表達(dá)、低表達(dá)者分別為57、27例，截止日期2015年12月，中位隨訪時(shí)間38個(gè)月。P-EGFR高表達(dá)、低表達(dá)者的總生存期分別為(41.6±3.3)、(55.3±5.2)月，二者相比，P<0.05；P-EGFR高表達(dá)、低表達(dá)者的無(wú)病生存期分別為(26.5±3.7)、(45.7±6.3)月，二者相比，P<0.05。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，P-EGFR的表達(dá)與食管鱗癌患者的總生存時(shí)間(χ2=5.79，P=0.016)及無(wú)病生存時(shí)間(P=0.004)均呈負(fù)相關(guān)(圖1)。COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型對(duì)患者性別、年齡、P-EGFR、分化程度、T分期、N分期、TNM分期等進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示P-EGFR高表達(dá)與總生存時(shí)間及無(wú)病生存時(shí)間均相關(guān)(P均<0.01)。

表1 不同臨床病理參數(shù)食管鱗癌患者的P-EGFR表達(dá)(例)

圖1 P-EGFR表達(dá)與食管鱗癌患者總生存時(shí)間、無(wú)病生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

EGFR為細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，屬于原癌基因C-erb-1表達(dá)產(chǎn)物。相關(guān)研究[7]表明，EGFR表達(dá)與細(xì)胞特異性分化具有密切關(guān)聯(lián)，其高水平表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。EGFR以單體形式存在于細(xì)胞膜上，而單體無(wú)活性，其激活依賴于其配體及其他 Erb B家族成員存在，如表皮生長(zhǎng)因子、雙向調(diào)節(jié)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α等[8]。當(dāng)EGFR與其配體結(jié)合后，可改變構(gòu)象，EGFR形成同源二聚體或者與其他成員形成異源二聚體，進(jìn)而激活酪氨酸酶區(qū)，導(dǎo)致自身磷酸化或者轉(zhuǎn)磷酸化，形成P-EGFR，進(jìn)而引起下游信號(hào)通路Ras/Raf/絲裂原細(xì)胞外激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶一絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)的激活，依次觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、血管生成及凋亡[5,9]，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及分化等。Hiraishi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中P-EGFR表達(dá)的陽(yáng)性率(98%)較高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，提示P-EGFR高表達(dá)可能成為預(yù)測(cè)口腔鱗癌極好的分子標(biāo)志之一。此外，胃腸道類癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤以及乳腺癌組織中P-EGFR均呈高表達(dá)[11,12]。且發(fā)現(xiàn)高表達(dá)P-EGFR的胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者與低表達(dá)或不表達(dá)P-EGFR的患者相比，預(yù)后更差，提示P-EGFR在腫瘤的發(fā)生和預(yù)后中起重要作用。

本研究中，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)臨床手術(shù)取得的食管鱗癌蠟塊標(biāo)本進(jìn)行EGFR磷酸化水平檢測(cè)，分析了P-EGFR與食管鱗癌患者臨床病理特征、患者術(shù)后無(wú)病生存時(shí)間及總生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組癌組織中P-EGFR的表達(dá)高于對(duì)照組，與以往研究報(bào)道一致[13]。P-EGFR的表達(dá)與食管鱗癌患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征無(wú)關(guān)。這與國(guó)內(nèi)外在口腔鱗癌和非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)果基本一致[11]，表明P-EGFR表達(dá)水平可能與腫瘤的惡性生物學(xué)行為無(wú)關(guān)。但盧紅等[14]報(bào)道，P-EGFR表達(dá)與食管鱗癌患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的P-EGFR高表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這可能與樣本量、研究對(duì)象、研究方法、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等有關(guān)，具體原因尚需進(jìn)一步研究。在預(yù)后分析中，P-EGFR低表達(dá)者總生存期、無(wú)病生存期均長(zhǎng)于P-EGFR高表達(dá)者。多元Cox回歸分析結(jié)果表明P-EGFR高表達(dá)是影響食管鱗癌生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與Papouchado等[11]研究結(jié)果類似，證實(shí)P-EGFR表達(dá)是判斷食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，食管鱗癌組織中P-EGFR高表達(dá)。P-EGFR高表達(dá)是影響食管鱗癌生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P-EGFR可能是一個(gè)預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。但P-EGFR表達(dá)是否可作為食管鱗癌患者的預(yù)后指標(biāo)尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究證實(shí)，更需要一項(xiàng)大型多中心雙盲實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)P-EGFR表達(dá)在食管鱗癌組織中的相關(guān)作用。

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新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015211C137)。

單莉(E-mail： shanlimed@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.014

R735

B

1002-266X(2017)07-0046-03

2016-10-06)