鄧詠梅，李園，張金山，劉少顏(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510150)

·基礎(chǔ)研究·

局部125I粒子植入聯(lián)合丹皮酚灌胃對裸鼠肺癌移植瘤的治療觀察

鄧詠梅，李園，張金山，劉少顏
(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510150)

目的 觀察局部125I粒子植入治療聯(lián)合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探討其可能作用機(jī)制。方法 Balb/c裸鼠52只，均制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型，隨機(jī)分成A、B、C、D組，每組13只。A組采用丹皮酚150 mg/kg灌胃治療，1次/d,共治療14 d；B組采用直視下經(jīng)皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入術(shù)治療；C組先行125I粒子植入聯(lián)合治療，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃, 1次/d,共治療14 d；D組為“冷粒子”(表觀活度為0)植入對照。 治療14 d時(shí)處死各組裸鼠，稱取瘤重(g)，計(jì)算腫瘤體積、腫瘤抑制率。觀察各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況，檢測各組腫瘤細(xì)胞水通道蛋白5(AQP5)、生存素(Survivin)蛋白。結(jié)果 治療14 d時(shí)A、B、C組瘤重均低于D組(P均<0.05)，A、B、C組腫瘤體積均小于D組(P均<0.05)；A、B、C組抑瘤率分別為35.6%、57.3%、74.4%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C、D組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C、D組AQP5蛋白的陽性表達(dá)率分別為30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D組比較，P<0.05。A、B、C、D組Survivin蛋白的陽性表達(dá)率分別為18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 組間兩兩比較，P均<0.05。結(jié)論 局部125I粒子植入聯(lián)合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的的抑瘤效果較好，其機(jī)制可能與其上調(diào)腫瘤組織AQP5蛋白表達(dá)、下調(diào)Survivin表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

肺癌；肺腫瘤；丹皮酚；125I粒子植入治療；水通道蛋白5；生存素

肺癌是目前我國惡性腫瘤致死的主要原因。放療是目前臨床常用的肺癌局部治療方法，其適用范圍廣，但部分肺癌患者特別是非小細(xì)胞肺癌患者的放射敏感性較低，治療過程中可產(chǎn)生放射抗拒，導(dǎo)致放療效果不佳[1]。125I粒子植入治療是一種新興的內(nèi)照射放射治療方法，其可提高腫瘤患者的腫瘤局部控制率[2]，已被用于用于肺癌、胃癌等多種實(shí)體瘤及術(shù)后殘存腫瘤的治療中。丹皮酚是牡丹、芍藥根皮中的活性成分,既往研究發(fā)現(xiàn)其對人乳腺癌細(xì)胞EMT6、食管癌細(xì)胞Eca-109、人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞等多種腫瘤有明顯的抑制作用[3～5]，是一種新的多靶點(diǎn)抗癌劑。最新研究[6，7]認(rèn)為,丹皮酚與化療藥物或放療藥物聯(lián)用可起到協(xié)同抗腫瘤作用。但目前關(guān)于關(guān)丹皮酚與125I粒子植入治療肺癌的相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了局部125I粒子植入治療聯(lián)合丹皮酚灌胃對A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 A549裸鼠肺癌移植瘤模型制作及分組 取7～10周的Balb/c裸鼠52只，雌雄不限，體質(zhì)量17.5～21.3 g，動(dòng)物合格證號(hào)為44007200025334。由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型5，腫瘤長徑7～8 mm，平均7.1 mm。將52只裸鼠隨機(jī)分成A、B、C、D組，每組13只，常規(guī)飼養(yǎng)后備用。

1.2 各組125I粒子局部植入與丹皮酚干預(yù)方法 A組采用丹皮酚(購自廣州晶晶生物科技有限公司，純度99.3%)150 mg/kg灌胃治療，1次/d,共治療14 d；B組采用直視下經(jīng)皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入術(shù)治療：125I放射性粒子由天津賽德醫(yī)藥科技有限公司提供，單粒籽源表觀活度為14.8 MBq。固定裸鼠后顯露瘤體，消毒瘤體及周圍皮膚，選擇瘤體中央部位為進(jìn)針點(diǎn)，將125I粒子置于5 mL針尖上，穿刺針(芯)穿刺后將125I粒子推入瘤體中，退出穿刺針，輕壓穿刺部位。將裸鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。每個(gè)腫瘤植入1顆125I粒子；C組先行直視下經(jīng)皮穿刺125I粒子植入術(shù)，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃治療, 1次/d,共治療14 d；D組為“冷粒子”(表觀活度為0)植入對照。

1.3 各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率、合并用藥效應(yīng)測算 治療第14 天處死各組裸鼠，完整剝出腫瘤組織并稱重(g)，測量腫瘤的三維徑長(a、b、c,cm)，按公式V=a×b×c/6 計(jì)算腫瘤體積(V,cm3)，根據(jù)腫瘤瘤重計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-干預(yù)組平均瘤重)/ 對照組平均瘤重×100%。根據(jù)Webb分?jǐn)?shù)乘積法測算C組的合并用藥效應(yīng)。(fa)1,2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]。(fa)1和(fa)2分別為藥物的瘤質(zhì)量抑制率，(fa)1，2為理論相加效應(yīng)，如果合并用藥效應(yīng)大于理論相加效應(yīng)，則表示有協(xié)同作用，如果合并用藥效應(yīng)等于理論相加效應(yīng)，則表示有相加作用。

1.4 各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法觀察各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。TUNEL試劑盒購自德國羅氏公司，所有操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。在高倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡情況，鏡下細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃染致密的塊狀熒光為陽性細(xì)胞，否則為陰性細(xì)胞，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 各組腫瘤組織AQP5、Survivin蛋白檢測 采用免疫組化染色法檢測各組細(xì)胞AQP5、Survivin蛋白。AQP5兔單克隆抗體試劑(批號(hào)EPR3747)為美國abacm公司產(chǎn)品，一抗兔抗Survivin多克隆抗體試劑為美國Thermo Fisher Scientific Inc 產(chǎn)品。所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。AQP5、Survivin蛋白表達(dá)情況見圖1。Survivin陽性表達(dá)為胞質(zhì)和或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色著染, AQP5陽性表達(dá)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞核不著色。計(jì)算AQP5、Survivin陽性表達(dá)率(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

注：左為Survivin陽性表達(dá)；右為AQP5陽性表達(dá)。

圖1 AQP5、Survivin蛋白表達(dá)情況

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較 治療14 d時(shí)各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較見表1。C組合并用藥理論效應(yīng)為72.5%，而實(shí)際抑瘤率為74.4%。

表1 治療14 d時(shí)各組裸鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較±s)

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，&P<0.05。

2.2 各組腫瘤組織AI比較 A、B、C、D組AI分別為20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，組間兩兩比較，P均<0.05。各組細(xì)胞凋亡情況見圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況

2.3 各組腫瘤組織AQP5、Survivin蛋白陽性表達(dá)率比較 A、B、C、D組AQP5蛋白陽性表達(dá)率分別為30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D組比較，P<0.05；A、C組AQP5蛋白陽性表達(dá)率高于D組，但P>0.05。A、B、C、D組Survivin蛋白陽性表達(dá)率分別為18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

125I粒子植入治療被認(rèn)為是一種具有高度適形的放療，可長時(shí)間、緩慢持續(xù)低劑量照射腫瘤本身，利用射線的電離輻射作用使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生輻射損傷，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但其存在劑量分布不均勻且依賴放射源的幾何空間排布的特點(diǎn)，可能導(dǎo)致治療靶區(qū)熱點(diǎn)或冷點(diǎn)的出現(xiàn)，影響對腫瘤的控制。電離輻射損傷是放射治療的基礎(chǔ),輻射損傷作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)是細(xì)胞核內(nèi)的DNA。中藥丹皮酚是牡丹、芍藥根皮中的活性成分,其藥理活性十分廣泛，對多種腫瘤有明顯的抑制作用，其抗腫瘤的分子機(jī)制之一是下調(diào)COX-2的表達(dá)，抑制Bcl-2基因、Survivin的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4，6]。丹皮酚與化療藥物或外照射放射線聯(lián)用，起協(xié)同抗腫瘤作用[6,7]，何峰等[7]研究發(fā)現(xiàn),本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用丹皮酚灌胃、125I粒子植入內(nèi)照射及聯(lián)合治療均能抑制A549肺腺癌的生長，且聯(lián)合用藥的抑瘤率高達(dá)74.4%，明顯高于丹皮酚、125I粒子單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的抑瘤率，提示丹皮酚聯(lián)合125I粒子植入治療對A549肺癌有協(xié)同抗腫瘤的作用。促進(jìn)細(xì)胞凋亡是125I粒子植入治療和丹皮酚灌胃抑制腫瘤生長的重要機(jī)制，本研究中，D組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見，形狀、大小各異，細(xì)胞核大而濃染；A、B、C組腫瘤組織鏡下可見腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，緊貼125I粒子周邊可見大片紅染壞死區(qū)，腫瘤組織壞死明顯，部分腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)核仁邊界不清、核破碎、核固縮。且A、B、C組AI高于D組，提示丹皮酚聯(lián)合125I粒子植入治療可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

AQP5主要位于呼吸道上皮表層的柱狀上皮細(xì)胞頂膜和黏膜下腺腺泡細(xì)胞頂膜，是一種高度選擇性的水通道蛋白，其主要作用是參與水的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡，并參與調(diào)節(jié)肺臟黏液、唾液分泌及眼淚的產(chǎn)生[8]。因此猜測：上調(diào)腫瘤細(xì)胞AQP5表達(dá)、開放水通道將致腫瘤細(xì)胞內(nèi)水含量增加，可望產(chǎn)生更多的氫氧自由基(OH·)，將形成更多DNA雙鏈斷裂，增加了間接輻射損傷，從而提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，可見AQP5的表達(dá)將對腫瘤細(xì)胞的放射敏感性產(chǎn)生重要的影響[9]，AQP5有可能是一種新型的輻射敏感標(biāo)志物和內(nèi)源性輻射增敏劑，丹皮酚對人A549肺腺癌腫瘤組織AQP5的表達(dá)上調(diào)不明顯，原因可能為丹皮酚能夠上調(diào)AQP5的表達(dá)，因?yàn)樵谥委熢缙贏QP5變化尚不明顯或丹皮酚對AQP5的表達(dá)呈劑量依賴性，此次實(shí)驗(yàn)的劑量沒達(dá)到閾值，或確實(shí)對AQP5的表達(dá)沒有調(diào)節(jié)作用，這些都有待于做大樣本實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探索。

放射增敏劑能提高腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性，從而增強(qiáng)射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞Survivin的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性有關(guān)，頭頸部、結(jié)直腸惡性腫瘤細(xì)胞對放射的抗拒與Survivin高表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與D組比較，各治療組的Survivin蛋白的表達(dá)均降低，C組的Survivin蛋白表達(dá)率降至9.5%±2.4%，與A、B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示丹皮酚與125I粒子植入治療聯(lián)用可明顯下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性，天然藥物丹皮酚可作為放射增敏劑用于腫瘤放療中。

綜上所述，125I粒子植入治療聯(lián)合丹皮酚對A549肺癌裸鼠的的抑瘤效果較好，兩者聯(lián)合應(yīng)用可克服單一內(nèi)照射治療的不足且產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤的作用，可提高治療療效，其機(jī)制與下調(diào)Survivin表達(dá)、提高腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但腫瘤的增殖受諸多因素的調(diào)控，且丹皮酚聯(lián)合125I粒子植入治療的具體作用機(jī)制尚需通過時(shí)間依賴性、劑量依賴性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步研究來證實(shí)。

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廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題基金資助項(xiàng)目(20151277)。

張金山(E-mail: zhangjinshangd137@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.009

R734.2

A

1002-266X(2017)07-0031-03

2016-08-30)