劉嘉，劉春來，宮雪，薛東煒，劉屹立，王平(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，沈陽 110032)

調節(jié)小分子GTP結合蛋白Rab27表達對人膀胱癌細胞Cyclin、p-FAK、p-IκB表達的影響

劉嘉，劉春來，宮雪，薛東煒，劉屹立，王平
(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，沈陽 110032)

目的 觀察調節(jié)小分子GTP結合蛋白Rab27表達對人膀胱癌細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)、磷酸化黏著斑激酶抗體(p-FAK)、核因子κB抑制蛋白(p-IκB)表達的影響。方法 取對數(shù)生長期人膀胱癌細胞系BIU-87(Rab27低表達細胞系)用Rab27質粒轉染，人膀胱癌細胞系5637(Rab27高表達細胞系)用Rab27干擾質粒轉染。采用Western blotting法檢測轉染前后BIU-87及5637細胞Rab27、Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB。結果 與Rab27質粒轉染前比較，轉染后BIU-87細胞Rab27的相對表達量升高，細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量均升高(P均<0.05)。與Rab27干擾質粒轉染前比較，5637細胞Rab27的相對表達量降低(P均<0.05)，細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量均降低(P均<0.05)。結論 轉染Rab27質粒的BIU-87細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB的表達升高。轉染Rab27干擾質粒的5637細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB的表達降低。Rab27可能通過調節(jié)NF-κB 、FAK信號通路的相關蛋白表達來影響膀胱癌細胞周期。

膀胱癌；小分子GTP結合蛋白；細胞周期蛋白；磷酸化黏著斑激酶抗體；核因子κB抑制蛋白

小分子GTP結合蛋白Rab27家族是囊泡運輸重要的參與和調節(jié)因子，可通過調節(jié)多泡核內(nèi)體的胞外分泌，外泌體釋放。最新研究發(fā)現(xiàn)，Rab27在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1, 2]。Rab27能夠促進雌激素受體(ER)陽性的乳腺癌細胞的侵襲性生長和遷移[3～5]。Rab27被認為是在黑色素瘤的進展中能夠提供生長優(yōu)勢的驅動基因[6]。有研究[7]表明，Rab27在膀胱癌細胞中過量表達，并促進細胞的增殖和侵襲過程。但是在促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，Rab27是通過哪些信號通路來發(fā)揮其生物學作用、其具體機制目前均不明確。以往研究[3]發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、血管生成和轉移有關，核因子κB(NF-κB)抑制蛋白(p-IκB)是NF-κB信號通路的主要成員。黏著斑激酶(FAK)信號通路在細胞擴散、遷移、生存等生物學進程中發(fā)揮重要作用[4]。FAK信號通路激活后可通過介導Akt 和 NF-κB 通路來抑制腫瘤細胞的凋亡，磷酸化黏著斑激酶抗體p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 是FAK信號通路的關鍵蛋白。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細胞周期蛋白E(Cyclin E)是臨床常用的細胞周期檢測指標。2014年6月～2015年10月，我們觀察了調節(jié)小分子GTP結合蛋白Rab27表達對人膀胱癌細胞中Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577)、p-IκB表達的影響，并分析Rab27在相關信號通路中的作用，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料、試劑及儀器 人膀胱癌細胞系BIU-87、5637均購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，當細胞密度達到90%時，0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞備用。TRIzol試劑購于美國Thermo Fisher公司，異丙醇購于Takara生物公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購于美國Gbico公司，Rab27質粒及Rab27干擾質粒購于廣州銳博生物科技有限公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購于美國Thermo Fisher Scientific公司。羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)，羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)均購于美國Proteintech公司。

1.2 Rab27質粒、Rab27干擾質粒轉染方法 取對數(shù)生長期BIU-87、5637 ，至細胞密度達到90%后制成細胞懸液，加入25 mL細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長成為單層狀態(tài)后，棄上清，加入適量0.01 mmol/L PBS沖洗2～3次，分別將50 μL Rab27質粒、Rab27干擾質粒溶于500 μL無血清RPMI1640中，混勻，加入10 μL Lipofectamine2000，混勻，室溫放置25 min，將混合物加入培養(yǎng)瓶中，再加適量RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第2天，收集細胞，備用。

1.3 轉染前后BIU-87及5637細胞Rab27檢測 采用Western blotting法。取適量轉染前、后對數(shù)生長期BIU-87、5637細胞，加入適量裂解液， 12 000 r/min、4 ℃低溫離心10 min，棄上清，BCA法進行蛋白定量。將目的蛋白與蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴中煮5 min，待冷卻后即可上樣。上樣結束后在電泳槽加入足量電泳液，增加電壓120 V，電泳時間90 min，電泳分離后電轉移至PVDF膜、封閉轉印后，孵育一抗。本實驗所用一抗抗體為：一抗Rab27 (1∶600)，GAPDH (1∶2 000)，4 ℃過夜。應用羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)，羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)，孵育二抗120 min。PVDF膜上均勻滴加適量發(fā)光液，行ECL底物發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)檢測各條帶的光密度值。以GAPDH為內(nèi)參，以Rab27的光密度與GAPDH光密度之比表示Rab27的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 轉染前后BIU-87、5637細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 、 p-IκB檢測 取適量轉染前、后對數(shù)生長期BIU-87、5637細胞，采用Western blotting法檢測Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、 p-FAK (Tyr576/577)、p-IκB蛋白。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。本實驗所用一抗抗體為：一抗Cyclin D1,、Cyclin E, p-FAK (Tyr925)、 p-FAK (Tyr576/577)、p-IκB(1∶1 000)，GAPDH (1∶2 000)，孵育條件為4度過夜。應用羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)，羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)，孵育二抗120 min。檢測各條帶光密度，以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白光密度與GAPDH光密度之比表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 轉染前后BIU-87、5637細胞Rab27相對表達量比較 轉染前BIU-87、 5637細胞Rab27的相對表達量分別為22.90±2.27、93.20±6.68，轉染后BIU-87、 5637細胞Rab27的相對表達量分別為121.47±6.21、17.32±3.18；與轉染前比較，轉染后BIU-87細胞Rab27的相對表達量升高，5637細胞Rab27的相對表達量降低，P均<0.05。

2.2 轉染前后BIU-87及5637細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量比較 轉染前后BIU-87及5637細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量比較見表1、2。

表1 轉染Rab27質粒前后BIU-87細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量比較±s)

注：與轉染前比較，#P<0.05。

表2 轉染Rab27干擾質粒前后5637細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB相對表達量比較±s)

注：與轉染前比較，#P<0.05。

3 討論

Rab為小分子GTP結合蛋白家族中最大的亞家族，編碼產(chǎn)生多種單體G蛋白，是真核動物細胞膜運輸?shù)姆肿娱_關[7～9]。Rab囊泡運輸系統(tǒng)在生物體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，直接或間接控制著許多膜受體的活化、代謝以及信號傳遞[10～12]。Rab蛋白家族在細胞生長、分化、凋亡以及細胞信號傳導中至關重要，當Rab蛋白的表達或活性異常時則誘發(fā)包括惡性腫瘤在內(nèi)的各類型疾病。已有文獻報道Rab蛋白在多種惡性腫瘤中存在異常表達的現(xiàn)象，其中包括胰腺癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌、皮膚癌以及乳腺癌等[13～16]。

細胞內(nèi)有一系列的具有周期調控功能的蛋白，可以確保細胞周期的有序進展。目前已發(fā)現(xiàn)的與細胞周期調控有關的分子主要有 3 大類，包括Cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKI)[17, 18]。Cyclin序列具有高度保守性，主要通過與CDK特異性結合，形成復合物發(fā)揮調節(jié)細胞周期以及基因轉錄的功能。不少研究表明，癌細胞的各種生物學行為，包括分化、衰老和凋亡均可以受到細胞周期調控。此外細胞周期蛋白與肝癌的惡性增殖和患者預后有明顯的相關性。抑制腫瘤細胞Cyclin的表達上調可以阻止腫瘤細胞的異常增殖并保護正常細胞，是藥物治療腫瘤的常用思路。Cyclin D1 在正常細胞的細胞周期G0期(某些細胞或某個階段的細胞可從G1期退出細胞周期而仍存活，稱為G0期)開始合成，其水平在G1中期達到高峰，S期表達開始下降，能促進細胞周期，與肝癌細胞增殖和不良預后有關。當Cyclin D1 與CDK4(或CDK60)結合后就可以激活后者的磷酸酶活性，使Rb磷酸化。磷酸化的Rb蛋白與轉錄因子E2F分離，E2F被釋放而發(fā)揮其轉錄因子的效應促使DNA合成有關的基因轉錄，從而促進細胞周期進入S期。與Cyclin D1相似，Cyclin E也發(fā)揮了同樣的功能并促進G1期向S期進展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾Rab27表達的5637細胞中Cyclin E、Cyclin D1相對表達量降低，而促進Rab27表達的BIU-87細胞中Cyclin E、Cyclin D1相對表達量升高。說明Rab27可能通過促進Cyclin E、Cyclin D1表達干擾膀胱癌細胞的細胞周期。

在膀胱癌細胞中Rab27對細胞生物學行為的調控是依賴怎樣的信號通路呢？我們對Rab27參與調控的MAPK、AKT、FAK、NF-κB等相關信號通路進行篩查，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞中Rab27能夠調節(jié) FAK (Tyr925)、FAK (Tyr576/577)和 IκB的磷酸化狀態(tài)。NF-κB是一種常見的轉錄因子，其未被激活時和IκB-α形成一個復合物，分布在細胞質中[20]。激活NF-κB的情況下，IκB-α會發(fā)生磷酸化，隨后被泛素-蛋白酶體途徑降解。NF-κB和IκB-α解聚后，被轉運到細胞核內(nèi)促進NF-κB依賴的基因轉錄。NF-кB的激活在肝癌形成中起到了關鍵作用，而抑制NF-кB激活則導致肝細胞凋亡并且產(chǎn)生抑制腫瘤的效應[21]。此外，NF-κB信號通路可以調控細胞凋亡和Bcl-2的表達。NF-κB信號通路已經(jīng)被報道在許多腫瘤包括膀胱腫瘤中發(fā)揮作用[22]。NF-κB的活化促進腫瘤的生長，侵襲和轉移。FAK是廣泛表達的參與整合素介導的信號轉導的胞漿蛋白酪氨酸激酶，其在許多生物學進程中發(fā)揮作用，包括細胞擴散，遷移和生存。FAK激活后通過介導Akt 和 NF-κB 通路來抑制腫瘤細胞凋亡過程[23, 24]。半胱天冬酶是細胞凋亡過程的起點，F(xiàn)AK能夠與半胱天冬酶相互作用。抑制半胱天冬酶活性后，細胞內(nèi)過量表達的FAK可以促進裸鼠的腫瘤形成以及細胞的集落的形成，細胞凋亡敏感性進一步降低[22]。在膀胱癌細胞中Rab27能夠激活FAK/NF-κB信號通路，同時Rab27能夠調控FAK/NF-κB信號通路下游靶蛋白cyclin E和cyclin D1的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，轉染Rab27的BIU-87細胞系中p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577)和p-IκB的表達升高，而在干擾Rab27表達的5637細胞系中p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577)和p-IκB表達降低，提示在膀胱癌細胞系中Rab27能夠調控FAK和NF-κB信號通路的活性,Rab27可能通過FAK/NF-κB信號通路，調控細胞周期蛋白表達，進而誘導腫瘤細胞的增殖以及侵襲過程。

綜上所述，促進細胞Rab27表達，BIU-87細胞Cyclin D1、 Cyclin E、p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB的表達升高。Rab27可能通過促進p-FAK (Tyr925)、p-FAK (Tyr576/577) 及 p-IκB的表達，上調Cyclin D1、 Cyclin E的表達。

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Effect of regulating expression of small molecule GTP binding protein Rab27 on Cyclin, p-FAK and p-IκB expression of human bladder cancer cells

LIUJia,LIUChunlai,GONGXue,XUEDongwei,LIUYili,WANGPing

(TheFourthAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China)

Objective To observe the effect of regulating the expression of small molecule GTP binding protein Rab27 on the cell cycle protein (Cyclin), phosphorylated focal adhesion kinase antibody (p-FAK) and nuclear factor κB (p-IκB) of human bladder cancer cells. Methods Rab27 plasmid and Rab27 siRNA were transfected into BIU-87 and 5637 cells in logarithmic phase, respectively. The levels of Rab27, Cyclin D1, Cyclin E, p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577) and p-IκB were analyzed by Western blotting in the bladder cancer BIU-87 and 5637 cells before and after transfection. Results Compared with the Rab27 plasmid transfected BIU-87 cells before transfection, the relative expression of Rab27 was increased, and the expression of Cyclin D1, Cyclin E, p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577) and p-IκB was increased (allP<0.05). After the Rab27 interference plasmid was transfected into 5637 cells, the relative expression of Rab27 was decreased (allP<0.05), and Cyclin D1, Cyclin E, p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577) and p-IκB relative expression was decreased (allP<0.05). Conclusion After the Rab27 plasmid is transfected into BIU-87 cells, the expression of Cyclin D1, Cyclin E, p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577) and p-IκB is increased. After the Rab27 interference plasmid is transfected into 5637 cells, the expression of Cyclin D1, Cyclin E, p-FAK (Tyr925), p-FAK (Tyr576/577) and p-IκB is decreased. Rab27 may affect the cell cycle of bladder cancer by regulating the expression of NF-κB and FAK signaling pathway.

bladder carcinoma; small molecule GTP-binding protein; cyclin; phosphorylated focal adhesion kinase antibody; nuclear factor κB inhibitor protein

遼寧省科學技術基金資助項目(2015225009)。

劉嘉(1979-)，男，博士研究生，主要研究方向為泌尿外科腫瘤。E-mail: coolsmart@live.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.003

R737.14

A

1002-266X(2017)07-0009-04

2016-09-15)