董陳誠，鐘漓，張廣鈺，王振冉，冉福林，陳霄(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,南寧5300；桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

芒柄花黃素對人胃癌細(xì)胞株MKN-45增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

董陳誠1，鐘漓2，張廣鈺2，王振冉2，冉福林2，陳霄2
(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,南寧530021；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 觀察芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細(xì)胞株增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法 取對數(shù)生長期人胃癌MKN-45細(xì)胞分為A、B、C、對照組，A、B、C組分別加入20、 40、 80 μg/mL芒柄花黃素培養(yǎng),對照組加入不含芒柄花黃素的完全培養(yǎng)基。采用MTT法觀察給藥24、48、72 h各組細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。采用 DAPI染色法評價(jià)其對MKN-45細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。采用Western blotting法檢測給藥48 h時(shí)各組細(xì)胞磷酸化IκB(p-IκB)及NF-κB p65。結(jié)果 隨芒柄花黃素濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率升高，且隨干預(yù)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖抑制率升高(P均<0.05)。給藥72 h時(shí)A、B、C、對照組的凋亡率分別為25.62%±2.57%、48.27%±3.18%、72.51%±4.35%、1.07%±0.54%，A、B、C組與對照組相比，P均<0.05。給藥48 h時(shí)A、B、C組細(xì)胞p-IκB、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，且隨芒柄花黃素濃度升高，細(xì)胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量增加，P均<0.05。結(jié)論 芒柄花黃素可抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞株的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為芒柄花黃素激活NF-κB信號(hào)通路。

芒柄花黃素；胃癌；胃腫瘤；細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

胃癌是消化道疾病惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲性、患者病死率均較高[1,2]。目前，化療、放療及手術(shù)治療在很大程度上提高了胃癌患者生存率[3]。常規(guī)化療藥物可降低腫瘤復(fù)發(fā)率，但存在毒性作用大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。近年來抗腫瘤藥物逐漸轉(zhuǎn)向于植物來源的天然化合物，這些天然藥物因其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)和多途徑的抗腫瘤作用，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[4～6]。芒柄花黃素分離自植物紅三葉草，為一種生物活性異黃酮，具有完善的生物功能和抗腫瘤作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)其可通過激活p38 MAPK途徑和清除氧自由基發(fā)揮腫瘤作用[8,9]，但目前尚未見其對人胃癌MKN-45細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路影響的報(bào)道。2015年6月～2016年4月，我們觀察了芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細(xì)胞株增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人胃癌MKN-45細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫。芒柄花黃素(純度>98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司。胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自上海拜力生物科技有限公司。細(xì)胞凋亡DAPI染色試劑盒購自上海臥宏生物科技有限公司。p-IκB、NF-κB p65和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自Sigma-Aldrich公司。Series8000 直熱式CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)。DM IRB倒置顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。GelDoc 2000 伯樂凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。ECL 檢測系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 MKN-45細(xì)胞分組及芒柄花黃素給藥方法 取對數(shù)生長期人胃癌MKN-45細(xì)胞株，加入含10%胎牛血清、150 U/mL鏈霉素、120 U/mL青霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞貼壁生長良好時(shí)，經(jīng)胰酶消化后在96 孔板中每孔加入 200 μL細(xì)胞液。培養(yǎng) 24 h 后將細(xì)胞分為干預(yù)組(A、B、C組)及對照組，A、B、C組分別加入20、 40、80 μg/mL芒柄花黃素培養(yǎng)(濃度參照文獻(xiàn)[9]), 對照組加入不含芒柄花黃素的完全培養(yǎng)基，將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀測 采用MTT法。分別取給藥24、48、72 h各組細(xì)胞，接種于96孔板中。每孔加入 20 μL的MTT 溶液，持續(xù)孵育4 h，吸除上清液，然后加入150 μL的DMSO，37 ℃勻速搖床15 min。采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在 490 nm 波長處的光密度值 (OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-OD干預(yù)組/OD對照組)×100%。

1.4 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用DAPI染色法觀察各組細(xì)胞凋亡情況。取給藥72 h時(shí)各組細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，用PBS漂洗5 min，之后DAPI工作液室溫染色15 min， PBS漂洗5 min，水溶性封片劑封片，最后置于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮伴隨染色加深，或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊；晚期的凋亡細(xì)胞則表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜所包繞，即凋亡小體。凋亡率計(jì)算方法：在200×視野下隨機(jī)找5個(gè)視野觀測，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞磷酸化IκB(p-IκB)及NF-κB p65蛋白檢測 采用Western blotting法。取給藥48 h對數(shù)生長期各組細(xì)胞，采用BCA法提取細(xì)胞總蛋白。以3:1體積比與上樣緩沖液混合,取20μL蛋白樣品上樣。PVDF膜，轉(zhuǎn)膜1.5 h。含5%脫脂奶粉的PBS液封閉1 h，分別加入IκB抗體(抗體稀釋度1∶500)和NF-κB p65抗體(抗體稀釋度1∶500)，4 ℃緩慢搖動(dòng)過夜，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(抗體稀釋度1∶5 000)室溫反應(yīng)1 h，超敏化學(xué)發(fā)光法顯色,凝膠分析系統(tǒng)分析記錄條帶光密度。用圖像分析系統(tǒng)分析,以積分光密度值表示相應(yīng)目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 隨芒柄花黃素濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率升高，且隨干預(yù)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖抑制率升高，P均<0.05。各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1 不同給藥時(shí)間各組細(xì)胞增殖抑制率比較±s)

注：與前一給藥時(shí)間比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 給藥72 h時(shí)A、B、C、對照組的凋亡率分別為25.62%±2.57%、48.27%±3.18%、72.51%±4.35%、1.07%±0.54%，A、B、C組與對照組相比，P均<0.05。給藥72 h時(shí)對照組細(xì)胞均勻分布，結(jié)構(gòu)形態(tài)完好，胞質(zhì)豐富。A組細(xì)胞體積皺縮變形，核收縮并且染色加深。B、C兩組細(xì)胞可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，胞核明顯固縮，呈致密的顆粒狀，核破碎明顯。

2.3 各組細(xì)胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較 給藥48 h時(shí)各組細(xì)胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較見表2。

表2 給藥48 h時(shí)各組細(xì)胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，&P<0.05。

3 討論

芒柄花黃素是中藥紅三葉草的主要活性成分，在當(dāng)歸及黃芪中也發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)，具有明顯的植物雌激素特點(diǎn)。植物雌激素，有時(shí)也稱為飲食雌激素，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)相似于雌激素，它們可能產(chǎn)生雌激素或抗雌激素作用，已有研究報(bào)道芒柄花黃素具有保護(hù)心血管[10,11]、防治骨質(zhì)疏松[12]、抗腫瘤[13，14]等植物雌激素作用。芒柄花黃素可防止血管生成和癌轉(zhuǎn)移，并在臨床中已用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療[15]，還能在體內(nèi)和體外通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞株的生長及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，例如非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌及骨肉瘤等[16～18]，目前對于其抗腫瘤機(jī)制研究報(bào)道主要有激活p38磷酸化水平，抑制內(nèi)源性Akt的磷酸化，降低細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平及上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)IGF-1/IGF-1R表達(dá)等[8,17,19]。

NF-κB是一類核轉(zhuǎn)錄因子，能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合，與癌癥、炎癥和自身免疫病等密切相關(guān)[20]。研究表明，NF-κB體系主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和調(diào)亡等的信息傳遞[21～23]。NF-κB信號(hào)通路的組成包括受體和受體近端信號(hào)接頭分子、NF-κB抑制劑IκB蛋白、IκB激酶(IKK)復(fù)合物和NF-κB二聚體[21]。在細(xì)胞中NF-κB與其抑制蛋白IκB家族成員結(jié)合成三聚體，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，只有被激活才從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核發(fā)揮重要作用。NF-κB通路經(jīng)典途徑的激活是由上游IKK介導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞受到促炎癥因子、病原體、氧化應(yīng)激、生長因子等刺激后，會(huì)激活I(lǐng)KK并使IκB磷酸化，然后IκB發(fā)生自身多泛素化，并隨后被蛋白酶體降解[21]。IκB降解后解離出NF-κB，活化的NF-κB釋放并進(jìn)入細(xì)胞核中與相應(yīng)的靶序列結(jié)合可對相當(dāng)多數(shù)量的基因發(fā)揮中心性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[24，25]： NF-κB作為可誘導(dǎo)并普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB能通過對腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 1(IL-1)、IL-6、IL-8 和GM-CSF 等基因的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié), 參與免疫細(xì)胞的增殖、分化及所引起的免疫應(yīng)答, 并起到中心調(diào)控作用。 NF-κB可通過對生長調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的促進(jìn)作用, 對細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)。④多種病毒的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子之間都存在著NF-κB結(jié)合位點(diǎn), 例如HIV、CMV 和SV40。目前，NF-κB在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用眾說紛紜，研究[26]證實(shí)NF-κB在腫瘤的生長,細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，它的激活能提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。近年來也發(fā)現(xiàn)NF-κB能調(diào)控下游因素，包括Bcl-2家族、IL-8、凋亡抑制蛋白(IAPS)家族、環(huán)氧合酶2(COX-2)、人類端粒反轉(zhuǎn)錄酶等在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中及腫瘤耐藥中起重要作用[27]。而Ryan等[28]證實(shí)NF-κB，特別是其RelA(p65)亞基在p53介導(dǎo)的凋亡過程中具有重要作用-NF-κB失活或者活性降低可取消p53 誘導(dǎo)的凋亡。Huh等[12]認(rèn)為, NF-κB p65 在胃癌早期中表達(dá)較高, NF-κB活化與淋巴浸潤呈負(fù)相關(guān), 與胃癌患者總生存率呈正相關(guān)。兩種截然相反的結(jié)論, 說明NF-κB到底是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是抑制細(xì)胞凋亡也與多種因素有關(guān)，這也提示了我們NF-κB除了具有促癌作用還可能發(fā)揮抑癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細(xì)胞有抑制增殖的作用，在同一時(shí)間段，隨芒柄花黃素濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率隨之升高，在同一濃度，隨芒柄花黃素干預(yù)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖抑制率升高，說明芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細(xì)胞具有時(shí)間和劑量依賴性。腫瘤細(xì)胞從良性發(fā)展成惡性的主要原因就是細(xì)胞對生長因子信號(hào)的敏感性增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞對凋亡程序調(diào)控的信號(hào)敏感性降低。我們使用DAPI染色實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物組的細(xì)胞凋亡率明顯比對照組高，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也同時(shí)增高，這說明了芒柄花黃素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制細(xì)胞增殖。凋亡，又稱程序性死亡，是由基因調(diào)控細(xì)胞衰老、維持機(jī)體正常運(yùn)行的重要機(jī)制，由一系列細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路精密調(diào)控。各種凋亡信號(hào)通過信號(hào)傳導(dǎo)通路傳至細(xì)胞內(nèi)，激活靶基因產(chǎn)生效應(yīng)，引起凋亡[17]。經(jīng)芒柄花黃素干預(yù)后的MKN-45細(xì)胞內(nèi)p-IκB、NF-κB p65蛋白水平明顯地上調(diào)，這提示芒柄花黃素激活了細(xì)胞內(nèi)NF-κB 信號(hào)通路，結(jié)合MTT及DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故我們推測芒柄花黃素激活MKN-45腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其抗胃癌活性的作用機(jī)制之一。

綜上所述，芒柄花黃素可抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞株的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為芒柄花黃素激活NF-κB信號(hào)通路。但NF-κB如何調(diào)控下游靶基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of formononetin on proliferation and apoptosis of human gastric cancer MKN-45 cells

DONGChencheng1,ZHONGLi,ZHANGGuangyu,WANGZhenran,RANFulin,CHENXiao

(1People[′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of formononetin on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer MKN-45 cells and its possible mechanism. Methods The human gastric cancer MKN-45 cells in the logarithmic growth phase were divided into groups A, B, C and the control group. Cells in the groups A, B and C were cultured and the culture medium was added with 20, 40 and 80 μg/mL of formononetin, respectively. The control group was not treated. The cell proliferation of MKN-45 cells was detected by MTT assay at 24, 48 and 72 h of formononetin treatment, and the growth inhibitory rate of MKN-45 cells was assessed. The effect of formononetin on morphological changes was evaluated using DAPI staining. The intracellular phosphorylated IκB (p-IκB) and NF-κB p65 protein expression was measured by Western blotting.Results MKN-45 cell proliferation was inhibited after being treated by formononetin with a time- and dose-dependent manner (allP<0.05). The apoptosis rates of groups A, B, C and the control group after 72-hour treatment were 25.62%±2.57%, 48.27%±3.18%, 72.51%±4.35% and 1.07%±0.54%, respectively (allP<0.05). The expression of p-IκB and NF-κB p65 protein in cells of groups A, B and C was significantly higher than that of the control group at 48 h after administration with a dose-dependent manner (allP<0.05).Conclusion Formononetin inhibits cell proliferation and induces apoptosis of MKN-45 cells, and the possible mechanism may be related to activation of NF-κB signaling pathway.

formononetin; gastric carcinoma; stomach neoplasms; cell proliferation; apoptosis

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(LX2014270)。

董陳誠(1981-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槲改c腫瘤外科。E-mail: 18282556@qq.com

鐘漓(1969-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槲改c腫瘤外科。E-mail: zhongli0302@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.002

R735.2

A

1002-266X(2017)07-0005-04

2016-09-11)