權(quán)冰娥，李 樹

(中國(guó)刑事警察學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系, 遼寧 沈陽(yáng) 110035)

新一代DNA測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)實(shí)踐中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展

權(quán)冰娥，李 樹

(中國(guó)刑事警察學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系, 遼寧 沈陽(yáng) 110035)

近幾十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，新一代測(cè)序技術(shù)得到了開發(fā)和應(yīng)用。DNA測(cè)序技術(shù)是人類探索生命奧秘的重要研究手段，隨著 DNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于法庭科學(xué)中懲罰、打擊罪犯的需要，其在法庭科學(xué)和法醫(yī)實(shí)踐中扮演著越來(lái)越重要的角色。測(cè)序技術(shù)歷經(jīng)一到四代的技術(shù)革新（二代之后的測(cè)序技術(shù)被稱為新一代測(cè)序技術(shù)），測(cè)序具有低成本、時(shí)間短、高通量的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息，最重要的是開發(fā)出了更多的遺傳位點(diǎn)。

新一代測(cè)序技術(shù)；法醫(yī)學(xué)；高通量

一、引 言

在過(guò)去的幾十年中，基因組測(cè)序技術(shù)幾乎涉及到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)和分子生物學(xué)的向前發(fā)展。由此人類從遺傳層面對(duì)于自身的了解多了一個(gè)層次，但人們并不滿足于當(dāng)前的研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)探索生物體生命奧秘的渴望還在不斷地增強(qiáng)。于是，人們將目光從單個(gè)基因位點(diǎn)的研究方向投向了全基因組層面，特別是人類基因組計(jì)劃的提出。人類對(duì)生命科學(xué)的研究進(jìn)入到了后基因組時(shí)代的今天，其中既包括了基礎(chǔ)研究中的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)，也涉及了應(yīng)用研究中的醫(yī)學(xué)診斷和農(nóng)作物育種等[1]。這些新興研究方向的相繼出現(xiàn)和發(fā)展，都需要對(duì)生物種類的全部基因組或全部的m RNA進(jìn)行測(cè)序，因而要求測(cè)序技術(shù)更成熟、價(jià)格更低廉、周期更短的大規(guī)模測(cè)序方法出現(xiàn)。目前，法醫(yī) DNA實(shí)驗(yàn)室測(cè)序技術(shù)是利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和毛細(xì)管測(cè)序技術(shù)來(lái)檢測(cè)短串聯(lián)重復(fù)序列（short t andem repeats，STR）遺傳標(biāo)記的長(zhǎng)度多態(tài)性信息及線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）序列多態(tài)性信息。這種測(cè)序技術(shù)在案件偵破和D NA數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)方面具有廣泛的應(yīng)用。時(shí)至今日，新一代測(cè)序技術(shù)（next generation seque ncing，NGS）以高通量而著稱，該技術(shù)還在發(fā)展研究中，廣泛的用于法醫(yī)學(xué)和法庭科學(xué)。本文對(duì)新一代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)和研究進(jìn)展做一介紹，并展望其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景。

二、第一代測(cè)序技術(shù)

Frederick Sanger和Walter Gilbert在1977年發(fā)明了 DNA末端終止法測(cè)序技術(shù)，從此開啟了人類探索測(cè)序技術(shù)的大門，為后來(lái)生物科技的快速發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Sanger法經(jīng)過(guò)三十多年的逐步發(fā)展，能測(cè)出堿基對(duì)相對(duì)長(zhǎng)度達(dá) 1000bp的序列，每個(gè)堿基的準(zhǔn)確度也有了較大的提高。Sanger測(cè)序法是最經(jīng)典的 DNA測(cè)序法，也是最基礎(chǔ)的測(cè)序法。

第一代測(cè)序技術(shù)主要依賴于手工操作，而且試劑損耗量大、準(zhǔn)確率低，以上種種因素極大地限制了測(cè)序的通量，降低了測(cè)序的效率，增加了測(cè)序的成本。

由于 Sanger測(cè)序法的種種限制和不足，在技術(shù)上經(jīng)過(guò)不斷變革，變革點(diǎn)主要分三類：1.用熒光染料標(biāo)記物代替了對(duì)人體有害的放射性同位素標(biāo)記物；2.用毛細(xì)管電泳技術(shù)代替了平板凝膠電泳技術(shù)；3.提高了平行測(cè)序的規(guī)模。

第一代測(cè)序技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、錯(cuò)誤率高、低通量等特點(diǎn)極大地限制了其在法醫(yī)實(shí)踐中的應(yīng)用，這些具有局限性的特點(diǎn)要求新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展。

三、新一代測(cè)序技術(shù)的研究進(jìn)展

（一）第二代測(cè)序技術(shù)

第一代測(cè)序技術(shù)的不足致使第二代測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程是新型二代測(cè)序平臺(tái)不斷涌現(xiàn)、速度不斷提升、成本不斷降低、通量不斷提高的過(guò)程。

1.454/Roche。2005年底，454公司推出了一系列利用微乳滴作為 PCR循環(huán)反應(yīng)器的測(cè)序儀，進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大規(guī)模的測(cè)序。這一革命性的發(fā)明開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序的先河，摒棄了人工手動(dòng)操作的繁瑣，推開了自動(dòng)化、高通量測(cè)序的大門。454公司研發(fā)的測(cè)序平臺(tái)測(cè)序讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，目前一次測(cè)序可獲得大于 100多萬(wàn)條讀長(zhǎng)達(dá)800～1000bp 的序列[2]（p.461），平均每個(gè)讀長(zhǎng)可達(dá)450bp。該技術(shù)與Sanger測(cè)序法相比，消耗的測(cè)序時(shí)間相對(duì)較少，僅需10h就能完成一個(gè)測(cè)序反應(yīng)；測(cè)序速度也相對(duì)提高了100倍；準(zhǔn)確性高達(dá)99%以上，快速方便，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模并行測(cè)序。

2.Solexa/Illumina。Genome Analyzer（GA）是 Illumina公司最初研發(fā)的測(cè)序儀，經(jīng)過(guò)快速的升級(jí)，測(cè)序平臺(tái)的通量從最初的 1G發(fā)展到大于 50G。Hiseq 2000是后來(lái) Illumina公司新發(fā)明的測(cè)序儀，適用范圍寬泛。它的核心技術(shù)是“DNA簇”和“可逆行末端終止”。一次運(yùn)行能產(chǎn)生通量達(dá)600G的量。Hiseq 2000在讀長(zhǎng)上不如454公司推行的各種測(cè)序儀，每次讀長(zhǎng)大約介于 75-100bp。但就檢測(cè)同聚物的準(zhǔn)確性而言，其優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了454公司，它的出錯(cuò)率一般在1%～1.5%之間，其在 36bp的準(zhǔn)確性是最高的。Illumina測(cè)序儀采用橋式 PCR擴(kuò)增法，與以往各種測(cè)序儀的擴(kuò)增法不同。Illumina測(cè)序技術(shù)有可擴(kuò)展的超高通量，而且需要的樣品量少，簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化、性價(jià)比高，因此是目前應(yīng)用最廣泛的二代測(cè)序技術(shù)。

3.ABI/SOLiDTM。SOLiD測(cè)序儀是 2007年通過(guò)ABI公司研制的，它的特點(diǎn)在于每個(gè)堿基能被閱讀兩次，由此可以檢查錯(cuò)配率，大大地降低了出錯(cuò)的可能性，在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和測(cè)序的出錯(cuò)率上也有很好的區(qū)分度。以前的測(cè)序儀常用的是聚合酶，而SOLiD測(cè)序儀一改常態(tài)，用連接酶替換了傳統(tǒng)的聚合酶，成為了一大新的創(chuàng)新點(diǎn)。該技術(shù)與 Sanger測(cè)序法相比，用熒光標(biāo)記物代替了放射性同位素標(biāo)記法，完全消除了放射性同位素對(duì)人體的有害性，同時(shí)也增強(qiáng)了辨識(shí)度。以上這些創(chuàng)新與改變，大大的提高了該技術(shù)的測(cè)序準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確率達(dá)99.94%。SOLi D3.0的測(cè)序通量為20G，而測(cè)序長(zhǎng)度僅為35-50bp，比Illumina測(cè)序系統(tǒng)的讀長(zhǎng)范圍還小，因此在測(cè)序長(zhǎng)度上有了一定的局限。

4.Danaher Motion/Polonator。Polonator測(cè)序儀是 Danaher Motion公司在之前測(cè)序儀的基礎(chǔ)上新研發(fā)的測(cè)序儀器。Polonator測(cè)序儀市場(chǎng)價(jià)格低廉，能為廣大用戶接受，深受顧客們的喜愛(ài)，用戶可以根據(jù)自己不同的研究目的變更測(cè)序操作條件。

5.Complete Genomics。Complete Genomic公司研發(fā)的 DNA納米矩陣與組合探針錨定連接測(cè)序法具有很高的容錯(cuò)能力。一臺(tái)儀器運(yùn)行一天能測(cè)出一個(gè)或兩個(gè)人的基因組，而且測(cè)序費(fèi)用低，化學(xué)試劑的消耗量也進(jìn)一步減少。

（二）第三代測(cè)序技術(shù)

PCR是第二代測(cè)序技術(shù)中重要也較核心的一步，由于在PCR擴(kuò)增過(guò)程中容易出現(xiàn)堿基錯(cuò)配或缺失的問(wèn)題，使得第二代測(cè)序技術(shù)的精確度仍不能最大化地提高。第三代測(cè)序技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷，對(duì)DNA單個(gè)分子測(cè)序代替了PCR反應(yīng)。

1.Helicos/HeliScope。HeliScope測(cè)序儀是市面上最先使用的單分子測(cè)序儀，它的獨(dú)特之處是不需要對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，只需在測(cè)序芯片上用熒光探測(cè)儀直接對(duì)單分子 DNA進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。雖然在檢查堿基替換突變的準(zhǔn)確性上很少出錯(cuò)，出錯(cuò)兩次的概率為 0.001%且可以直接測(cè)序RNA，但在其他方面仍然存在一些不足。如：有大量的不發(fā)光、被污染且沒(méi)被標(biāo)記的堿基存在，在檢測(cè)堿基的缺失時(shí)出錯(cuò)率極高；該測(cè)序儀的讀長(zhǎng)長(zhǎng)度短；運(yùn)行一次的產(chǎn)量低。

2.Pacific Biosciences/SMRT。SMRT(Sing le Molecule Real Time Sequencing)以芯片為載體進(jìn)行測(cè)序。目前，單個(gè)片段的測(cè)序長(zhǎng)度可達(dá)20kb，平均長(zhǎng)度也有1kb多，測(cè)序消耗時(shí)間短，典型的測(cè)序運(yùn)行一次時(shí)間低于 15分鐘，一般的測(cè)序從樣品制備到測(cè)序完成時(shí)間低于 24小時(shí)。測(cè)序速度達(dá)到 1.5nt/秒，該測(cè)序儀的準(zhǔn)確性不高，準(zhǔn)確率僅達(dá)85%，但它的出錯(cuò)是隨機(jī)出現(xiàn)的，并不會(huì)隨著讀長(zhǎng)的增加而增加，相信將來(lái)會(huì)慢慢被克服[3]。

3.Ion Torrent/基因解碼器。Ion Torrent公司發(fā)明的基于硅芯片的個(gè)人染色體檢測(cè)儀，是目前市面上體積規(guī)格最小、測(cè)序價(jià)格最低的基因解碼器[4]。它能在2小時(shí)內(nèi)解讀1000萬(wàn)nt的長(zhǎng)度。市場(chǎng)售價(jià)低廉，能被大多數(shù)人接受，科學(xué)家們?cè)?012年用該儀器在24h內(nèi)完成了人類基因組的測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)可以直接測(cè)序RNA和甲基化的DNA序列，而第二代測(cè)序技術(shù)不能[5]。

（三）第四代測(cè)序技術(shù)

第二代和第三代測(cè)序技術(shù)都是依賴一定量的生物酶、化學(xué)試劑及熒光標(biāo)記物的發(fā)光性能測(cè)序的。這就需要一系列與其相適應(yīng)的生化反應(yīng)系統(tǒng)、光學(xué)成像或監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的產(chǎn)品產(chǎn)生，大大地增加了儀器的復(fù)雜性和成本。而且讀取序列耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、材料損耗大。為了避免以上這些弊端的出現(xiàn)，人們提出了第四代測(cè)序技術(shù)。

第四代測(cè)序技術(shù)的主要思想是研發(fā)出不需要熒光物質(zhì)，不使用生化試劑，就可以直接、快速、低成本地測(cè)出DNA序列的新型測(cè)序技術(shù)。第四代測(cè)序技術(shù)存在一定的局限性，還處于概念性研究階段，但就目前情況來(lái)看，將來(lái)的新一代DNA測(cè)序系統(tǒng)很可能從其中產(chǎn)生[6]。

四、新一代DNA測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

NGS技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，為刑事偵查和司法審判提供了極大的幫助。例如，Illumina公司研發(fā)的MiSeq FGx法醫(yī)基因組學(xué)系統(tǒng)能夠大規(guī)模并行測(cè)序 59個(gè) STR，94個(gè)身份信息 SNP，54個(gè)祖先信息性SNP和24個(gè)表型信息性SNP。這些信息能為偵查提供方向，為司法審判提供有力證據(jù)，為個(gè)人識(shí)別及尋找祖先提供科學(xué)依據(jù)。目前測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要有分析長(zhǎng)度和序列多態(tài)性的STR技術(shù)、mtDNA全基因組分析、y-STR分析、預(yù)測(cè)種族背景和外觀特征的SNP分析、微生物群落的分析及對(duì)表觀遺傳的分析。

（一）短串聯(lián)重復(fù)序列分析

STR自動(dòng)分型技術(shù)廣泛應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析實(shí)驗(yàn)室，具有自動(dòng)化程度高、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點(diǎn)?，F(xiàn)如今，法醫(yī)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的建立已完全依賴于STR分型技術(shù)，并且該技術(shù)是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主流技術(shù)。NGS技術(shù)能顯著提升STR遺傳標(biāo)記的多態(tài)性信息量，即由長(zhǎng)度多態(tài)水平提高到序列多態(tài)水平，顯著提升法庭科學(xué)核心 STR基因座的個(gè)體識(shí)別效力。Gettings KB[7]等人用NGS技術(shù)對(duì)不同人種的22個(gè)常染色體STR進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)序比較分析，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)基因座的效果相當(dāng)突出，6個(gè)基因位點(diǎn)分別是：D12S391、D2S1338、D21S11、D8S1179、VWA、D3S1358。Kyoung-Jin Shin[8]等人研究了17個(gè)STR基因座的序列多態(tài)性問(wèn)題，運(yùn)用NGS技術(shù)對(duì)STR序列多態(tài)信息進(jìn)行分析，為法庭科學(xué)審判罪犯提供充足的依據(jù)。

（二）線粒體全基因組分析

mtDNA的測(cè)序最早采用的是Sanger測(cè)序法，為了能提高個(gè)人識(shí)別能力，必須要在mtDNA中使用更多的多態(tài)性位點(diǎn)。mtDNA在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用主要是對(duì)其高變Ⅰ區(qū)（16024～16365bp）和高變Ⅱ區(qū)（73～340bp）的DNA進(jìn)行測(cè)序。mtDNA全基因組的研究受到的關(guān)注越來(lái)越多，范圍越來(lái)越廣，尤其在法醫(yī)學(xué)中的個(gè)人識(shí)別、親屬鑒定以及嫌疑的排除方面的應(yīng)用具有重要的作用。Parson[9]用大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)成功地從受損頭發(fā)樣本中測(cè)出mtDNA基因組數(shù)據(jù)。另外，對(duì)單倍型的遺傳標(biāo)記的判斷依賴于準(zhǔn)確的人群調(diào)查，已有的數(shù)據(jù)大多僅基于非編碼區(qū)的數(shù)據(jù)，隨著越來(lái)越多人認(rèn)識(shí)mtDNA全基因組，對(duì)它的分析更全面，更準(zhǔn)確[10]。

（三）Y染色體分析

測(cè)序并分析Y染色體上的基因位點(diǎn)，可以對(duì)男性進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，也可以解決來(lái)自同一父本的多個(gè)混合樣本之間的鑒定問(wèn)題。Willems[11]利用Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)定 Y染色體 STR全基因組中 2-6bp重復(fù)單元 Y-STR的突變率，他們使用1000個(gè)基因組計(jì)劃和西蒙斯基因組多樣性項(xiàng)目的數(shù)據(jù)，對(duì)4500個(gè)Y-STR進(jìn)行基因分型，再通過(guò)追蹤每個(gè)位點(diǎn)超過(guò)222,000個(gè)堿基來(lái)獲得702個(gè)多態(tài)性 STR的突變率估計(jì)，這是迄今為止Y-STR突變率的最大收集量。最后，他們通過(guò)這一系列驗(yàn)證確定了在法醫(yī)學(xué)和遺傳譜系中具有潛在應(yīng)用的Y-STR，評(píng)估了父親和兒子之間Y染色體的區(qū)分能力并估算了Y-STR基因型的能力。

（四）種族背景和外觀特征的預(yù)測(cè)分析

近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)研究已經(jīng)確定了一些SNP可以幫助預(yù)測(cè)種族背景和外觀特征。這在幫助鎖定或刻畫罪犯的問(wèn)題上具有極大的幫助，目前有報(bào)道稱在預(yù)測(cè)頭發(fā)或皮膚顏色的相似度已經(jīng)達(dá)到了 80%～90%，但在身高的預(yù)測(cè)上差異較大，準(zhǔn)確性不高。也可以利用NGS技術(shù)給外觀特征進(jìn)行畫像，例如除了可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)頭發(fā)、眼睛、皮膚的顏色外，還能推測(cè)鼻子、耳朵、雙眼皮、單眼皮、嘴唇和軟組織的特征及頭發(fā)的曲直等，幫助進(jìn)行個(gè)體識(shí)別[12]。這為提高辦案能力，縮小偵查范圍，為及時(shí)抓捕并制裁罪犯提供有力的幫助。

Churchill[13]利用 MiSeq FGx系統(tǒng)對(duì) 725個(gè)樣本中的四類主要人群（中國(guó)人，非裔美國(guó)人，美國(guó)高加索人和西南西班牙裔）的剖面完整性、讀數(shù)深度、相對(duì)基因座表型和等位基因的覆蓋率進(jìn)行了詳細(xì)的性能評(píng)估。通過(guò)對(duì)172個(gè)SNP基因座的等位基因頻率和人口數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品生成的祖先信息和表型信息，和預(yù)測(cè)的人群分類幾乎一致。

（五）法醫(yī)微生物分析

微生物信息的分析在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究越來(lái)越廣，越來(lái)越重要。Habtom[14]用Roche 454，Illumina MiSeq和IonTorrent PGM平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)區(qū)分了相鄰?fù)寥乐械奈⑸锓N群，說(shuō)明了其潛在的微生物痕跡在法醫(yī)學(xué)鑒定中的作用。Guo[15]使用Illumina MiSeq測(cè)序儀研究了細(xì)菌群落可以用作估計(jì)死者的死亡時(shí)間，但還需要進(jìn)一步的研究。

（六）表觀遺傳分析

表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不變的情況下，由其他機(jī)制引起的可遺傳的改變，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質(zhì)重塑等[16]。表觀遺傳學(xué)的研究與NGS技術(shù)密不可分，現(xiàn)在已形成了以 NGS為基礎(chǔ)的各種表觀遺傳學(xué)測(cè)序及研究方法，如：全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序法、甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)等等[17]。在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用上，表觀遺傳在雙胞胎的研究中有了極大的進(jìn)展。有研究表明，同卵雙胞胎的表觀遺傳特征隨著年齡的增長(zhǎng)，變化越來(lái)越大。

綜上所述，科技在向前發(fā)展，新一代測(cè)序技術(shù)也在不斷更新和完善，其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。

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（責(zé)任編輯：李 剛）

Application of New Generation DNA Sequencing Technology in Forensic Practice and Its Research Progress

QUAN Bing-e，LI Shu
(Department of Forensic Medicine, National University of China, Shenyang Liaoning 110035, China)

In recent decades, with the rapid development of molecular biology and basic medicine, a new generation of sequencing technology has been developed and applied. DNA sequencing technology is an important research method o f hum an exploration o f life myst ery. With t he app lication o f DNA sequencing technology in court science to punish and combat crime, it plays an increasingly important role in forensic scie nce and forensic p ractice. Sequencing te chnology is a ge neration, two generation,three gen erations and four g enerations o f techno logical innov ation (second gen eration aft er the sequencing technology is called a new g eneration of sequencing technology), sequencing with lo w cost,time is short, high-throughput characteristics, can quickly and accurately Access to genetic information of organisms, the most important thing is to develop more genetic sites.

new generation sequencing technology; forensic science; high throughput

D919.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2096-0727(2017)06 -0045-05

2017-08-30

權(quán)冰娥（1993-），女，甘肅白銀人，碩士研究生。研究方向：人體檢驗(yàn)與鑒定技術(shù)。

李 樹（1964-），女，吉林遼源人，教授，雙學(xué)士。研究方向：法醫(yī)物證學(xué)。