常菊花 李少斌 田曉麗

長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北荊州 434025

1 生物標(biāo)志物簡(jiǎn)介

簡(jiǎn)單的急性毒性試驗(yàn)不能準(zhǔn)確地反映當(dāng)今環(huán)境污染物的污染現(xiàn)狀，所以低劑量的慢性和亞慢性試驗(yàn)越來(lái)越受到重視。生物檢測(cè)包括體內(nèi)試驗(yàn)(In vivo test)和體外試驗(yàn)(In vitro test)。通常，體內(nèi)試驗(yàn)指以活體動(dòng)物為對(duì)象進(jìn)行環(huán)境污染物的內(nèi)分泌干擾作用的研究。體外試驗(yàn)的設(shè)計(jì)基于大部分內(nèi)分泌干擾物在體內(nèi)的作用機(jī)制。魚(yú)類經(jīng)常被用生殖或內(nèi)分泌毒理學(xué)研究，魚(yú)類慢性活體試驗(yàn)常與生物標(biāo)志物聯(lián)系起來(lái)。目前生物標(biāo)志物(biomarker)可分效應(yīng)標(biāo)志物(effect biomarker)、暴露標(biāo)志物(exposure biomarker)和易感性標(biāo)志物(susceptibility biomarker)三類。效應(yīng)標(biāo)志物是指生物暴露于污染物后可測(cè)出的生理、生化、行為或其他改變的指標(biāo)。暴露標(biāo)志物指測(cè)定生物組織、體液或排泄物中吸收的污染物本身、其代謝產(chǎn)物或者與內(nèi)源物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物。易感性生物標(biāo)志物是針對(duì)不同個(gè)體對(duì)外源性化合物的生物易感性指標(biāo)，易感性的形成的一個(gè)主要原因是基因的多態(tài)性。

2006年世界自然基金會(huì)列出了具有生殖—內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，農(nóng)藥類環(huán)境激素所占比例最大，其中農(nóng)藥及其代謝物有九十多種。

表1 具有生殖—內(nèi)分泌干擾效應(yīng)農(nóng)藥列表Table1 WWF list of pesticides with reproductive or endocrine disrupting effects

2 硬骨魚(yú)雌激素受體

1962年，Jensen等用放射配體結(jié)合分析法(radio ligand binding assay，RU)首先證實(shí)了雌激素受體(Estrogen receptor，ER)的存在。ER是一種糖蛋白，分子量約35000～90000，具有特異性強(qiáng)，親和力高，結(jié)合能量低的特性，ER的生物特性極不穩(wěn)定，與雌二醇(E2)結(jié)合后的復(fù)合物則較穩(wěn)定。雌激素受體由三個(gè)獨(dú)立但又相互影響的功能區(qū)構(gòu)成：氨基末端、DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain，DBD)和羥基末端的配體結(jié)合區(qū)(1igand binding domain，LBD)。

與高等脊椎動(dòng)物不同的是，多數(shù)硬骨魚(yú)類中ERβ存在異型體，它們分別由兩個(gè)不同基因(ERβ1和ERβ2)編碼。硬骨魚(yú)類ER種類和生理功能狀況遠(yuǎn)比高等脊椎動(dòng)物復(fù)雜。關(guān)于雌激素受體的研究，硬骨魚(yú)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于哺乳動(dòng)物。到目前為止，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、青鳉(medaka)、梭魚(yú)(Mugilsoiuy)、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、擬鯉(Rutilusrutilus)、鯰魚(yú)(catfish)和黑頭軟口鰷(FatheadMinnow)等雌激素受體序列。黑頭軟口鰷(FatheadMinnow)組織分布分析表明，ERmRNAs在兩性魚(yú)類的腦、垂體、肝臟和性腺的表達(dá)非常高，在腸、腮和肌肉也有表達(dá)。目前雌激素受體的研究主要集中在對(duì)雌激素受體的識(shí)別、定位、基因克隆、基因表達(dá)上，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的研究很少。

3 硬骨魚(yú)芳香化酶

芳香化酶可以催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素合成中的關(guān)鍵酶。芳香化酶基因是目前了解比較清楚的影響魚(yú)類性別的基因，芳香化酶抑制劑可抑制日本褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)P450arom mRNA表達(dá)而成為表型雄魚(yú)。赤點(diǎn)石斑魚(yú)兩種芳香化酶分別由不同的基因編碼。腦芳香化酶(P450aromB)的cDNA全長(zhǎng)為1901 bp，編碼509氨基酸；性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA全長(zhǎng)為1833 bp，編碼518氨基酸。序列分析結(jié)果表明，赤點(diǎn)石斑魚(yú)兩種芳香化酶cDNA序列的同源性為51.6%。芳香化酶可以影響魚(yú)類的性腺發(fā)育和性別轉(zhuǎn)化、血清中性類固醇激素含量等。魚(yú)腦和垂體中的芳香化酶水平比其他脊椎動(dòng)物高出100～1000倍。在魚(yú)類性別分化和性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，芳香化酶是相對(duì)研究較多的一種酶類，它的活性和表達(dá)的強(qiáng)弱，在一定程度上可以反映出雌激素的生物合成狀況。目前許多硬骨魚(yú)類P450芳香化酶的cDNA已被克隆，這些cDNA編碼的氨基酸序列與兩棲類、鳥(niǎo)類、哺乳類等芳香化酶cDNA編碼的氨基酸序列同源性較高，表明芳香化酶在進(jìn)化上和功能上相當(dāng)保守。

4 硬骨魚(yú)卵黃蛋白原

卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體，它對(duì)魚(yú)類的生殖非常重要。肝臟VTG合成過(guò)程是下丘腦一垂體一性腺神經(jīng)內(nèi)分泌軸通過(guò)環(huán)境或內(nèi)源信號(hào)激活下發(fā)生的自然過(guò)程。一般只有在性成熟的雌魚(yú)體內(nèi)，足夠量的雌激素(17β-雌二醇)作用于肝臟肝細(xì)胞膜上的雌激素受體，從而誘導(dǎo)卵黃蛋白原基因表達(dá)，產(chǎn)生卵黃蛋白原。隨后VTG進(jìn)入血液循環(huán)達(dá)到卵巢，進(jìn)入卵母細(xì)胞，分解成卵黃脂磷蛋白和卵黃高磷蛋白，用作初生胚胎的營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源，支持胚胎發(fā)育。卵黃蛋白原只在成熟雌性卵生動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，幼年和雄性動(dòng)物體內(nèi)則無(wú)，但是可以在外源性雌激素誘導(dǎo)其表達(dá)。卵黃蛋白原(Vitellogenin)可以考慮作為一個(gè)指示環(huán)境內(nèi)分泌干擾物污染的生物標(biāo)志物。

5 展望

對(duì)硬骨魚(yú)雌激素、芳香化酶、卵黃蛋白原的結(jié)構(gòu)和功能研究可以進(jìn)一步為生物標(biāo)志物的選擇提供理論依據(jù)。