李 娜，王淑霞，木胡牙提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理中心健康體檢部，烏魯木齊 830054)

IL-6-174G/C及-572C/G位點基因多態(tài)性與新疆NVAF人群及民族差異性分析*

李 娜，王淑霞，木胡牙提△

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理中心健康體檢部，烏魯木齊 830054)

目的 探討新疆地區(qū)白細胞介素-6(IL-6)-174C/G及-572C/G位點的基因多態(tài)性，與非瓣膜性心房顫動(NVAF)的關(guān)系及新疆地區(qū)漢族、哈薩克族(哈族)IL-6基因多態(tài)性的民族差異性。方法 分別選擇新疆地區(qū)漢族、哈族NVAF對象79、78例(漢族、哈族NVAF組)，漢族、哈族非心房顫動對象75、79例(漢族、哈族對照組)，采集靜脈血提取DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對各組對象的IL-6基因-174G/C及-572C/G的多態(tài)性進行分析。結(jié)果 IL-6 -572G在NVAF組中等位基因頻率明顯高于對照組(χ2=4.076,P<0.05)；NVAF組和對照組IL-6基因-572G/C位點G等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.519，95%CI:1.087～2.122，P<0.05)，而在漢族及哈族對照組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；年齡大于或等于75歲(OR=6.468，95%CI:2.427～17.240)、 左心房內(nèi)徑(OR=1.053，95%CI：1.022～1.085)，是發(fā)生房顫的獨立危險因素；左心室射血分數(shù)(OR=0.946，95%CI:0.922～0.971)是防止房顫發(fā)生的保護因素。各組IL-6基因-174G/C位點 C、G等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。結(jié)論 IL-6-572G/C位點G等位基因是NVAF遺傳易感性的危險因子，IL-6-174G/C位點的基因多態(tài)性與心房顫動的易感性無關(guān)。

非瓣膜性心房顫動；基因多態(tài)性；白細胞介素 6；民族差異

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，一般人群發(fā)生AF率為0.4%～1.0%，80歲以上老年人的發(fā)生率高達9%[1]。有研究表明，炎癥因子不僅可以在復(fù)律前預(yù)測復(fù)律的成功率，而且對復(fù)律后AF復(fù)發(fā)的預(yù)測有價值[1-2]。AF的發(fā)生和持續(xù)與白細胞介素(interleukin，IL)及其基因型明顯相關(guān)。Terry等[3]報道指出IL-6-174G/C多態(tài)性中，C等位基因可增強IL-6的轉(zhuǎn)錄。鄭金國等[4]報道指出IL-6-572C/G基因多態(tài)性中，G等位基因可增強IL-6的轉(zhuǎn)錄。本研究采用病例對照研究設(shè)計對新疆漢族及哈薩克族(哈族)人群中選取上述2個位點的多態(tài)性與非瓣膜性心房顫動(non-valvular atrial fibrillation，NVAF)易感性進行相關(guān)探討，同時分析上述2個位點是否存在民族差異性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2011年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心住院明確診斷為NVAF的漢族(n=79)、哈族(n=78)患者。納入標準為NVAF患者有除風濕性心臟病以外的其他心臟病(如冠心病、充血性心肌病等)和全身性疾病(如高血壓、甲狀腺功能亢進、糖尿病等)而同時合并發(fā)生AF的漢族及哈族患者。對照組選取與病例組來自同一病區(qū)、無AF病史的漢族及哈族患者，所有的心電圖(包括Holter)無AF表現(xiàn)的漢族(n=75)、哈族(n=79)患者。NVAF組和對照組均無血緣關(guān)系，無異族通婚家族史，排除合并瓣膜性心臟病、肝腎疾病、2周內(nèi)外傷、炎癥反應(yīng)、風濕性疾病及惡性腫瘤患者。本研究已經(jīng)獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，每例受試者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集各組患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，裝入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)-20 ℃冰箱保存,使用北京天根生化科技有限公司提供的血液基因組DNA 提取系統(tǒng)(RelaxGene Blood DNA System)提取基因組DNA。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 參照文獻[3-4]方法設(shè)計引物，由大連寶生物工程有限公司合成。IL-6基因-174G/C位點引物序列，上游：5′-GCC AAA GTG CTG AGT CAC-3′，下游：5′-AAT CTT TGT TGG AGG GTG-3′；IL-6基因-572C/G位點引物序列，上游：5′-TGA AGC AGG TGA AGA AAG -3′，下游：5′-TTT CCT CTG ACT CCA TCG-3′。

1.2.3 聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測 采用PCR擴增目的DNA片段,然后將待檢測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切,限制性內(nèi)切酶識別并切割特異的序列,然后將酶切后的產(chǎn)物進行電泳,再由限制酶圖譜(restriction map)分析此段序列的特異切位點,即由片段的多樣性來比對不同來源基因序列的差異性?；驍U增儀(Applied Biosystem 2720 Thermal Cyeler，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL:上下游引物各0.5 μL,2.5 mmol/L的MgCl23.0 μL，10×緩沖液3.0 μL，0.1 mmol/L的dNTP混合物3.0 μL，多聚酶0.5 U，模板DNA 2.0 μL，去離子水7.0 μL。PCR反應(yīng)條件：IL-6-174G/C為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，進行40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。IL-6-572C/G為94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性60 s，58.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。每批反應(yīng)均以超純水替代DNA作為陰性對照。

1.2.4 擴增產(chǎn)物限制性酶切 限制性內(nèi)切酶均為Newlunberd公司產(chǎn)品。IL-6-174G/C擴增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶NlaⅢ，20.0 μL酶切反應(yīng)體系包括：10×緩沖液2.0 μL，PCR產(chǎn)物10.0 μL，10.0 U限制性內(nèi)切酶0.5 μL,并加超純水7.5 μL，37 ℃溫浴9 h進行酶切。IL-6-572C/G擴增產(chǎn)物使用BsrBI限制性內(nèi)切酶，20.0 μL酶切反應(yīng)體系包括：10×緩沖液2.0 μL，PCR產(chǎn)物10.0 μL，10.0 U限制性內(nèi)切酶0.5 μL，并加超純水7.0 μL，37 ℃溫浴11 h進行酶切。

1.2.5 基因型判定方法 IL-6-174G/C酶切產(chǎn)物以經(jīng)3%瓊脂糖在120 V電壓下電泳40 min，IL-6-572C/G酶切產(chǎn)物以經(jīng)2%瓊脂糖在120 V電壓下電泳30 min，在Gel Doc 2000紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。每次酶切反應(yīng)均以一個確定的純合子基因型作為對照，基因分型結(jié)束后，隨機抽取10%的樣本進行重復(fù)分型，吻合率達100%。

2 結(jié) 果

2.1 IL-6基因多態(tài)性 在啟動子-174位點發(fā)生了G→C基因替換，產(chǎn)生G、C兩種等位基因。擴增產(chǎn)物片段大小為247 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，電泳可見3種基因型。若該位點為C，則形成NlaⅢ酶切位點，即為等位基因C；反之，為等位基因G。酶切后得到226、21 bp兩條片段為CC型；247、226、21 bp 3條片段為GC型；單條247片段為GG型(21 bp片段較小在電泳圖上未顯示)。IL-6基因在啟動子-572位點發(fā)生了C→G基因替換，產(chǎn)生C、G兩種等位基因。擴增產(chǎn)物片段大小為223 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，電泳可見3種基因型。若該位點為G，則BsrBI形成酶切位點，即為等位基因G；反之，為等位基因C。酶切后得到154、69 bp兩條片段為CC型；223、154、69 bp 3條片段為GC型；單條223片段為GG型(69 bp片段較小在電泳圖上未顯示)，見圖1、2。

M:標記物；1、3、4、5：GG型；2：GC型。

圖1 IL-6 -174G/C基因型分布

M:標記物；1、6、7：CG型；2、3：GG型；4、5：CC型。

圖2 IL-6-572C/G基因型分布

2.2 各組患者的一般情況比較 NVAF組與對照組患者的一般資料比較，其中高齡(≥75歲)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而平均年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、冠心病、心肌病的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者心臟超聲結(jié)果中左心房內(nèi)徑(LAD)、左心室射血分數(shù)(EF)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；右心房內(nèi)徑(RAD)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 NVAF與對照組患者的臨床特征及心臟超聲結(jié)果比較

續(xù)表1 NVAF與對照組患者的臨床特征及心臟超聲結(jié)果比較

2.3 Hardy-Weinberg平衡、等位基因及基因型頻率比較 4組患者IL-6-174G/C基因多態(tài)性基因型中未出現(xiàn)CC型，GG型檢出率為99.04%，GC型的檢出率為0.96%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF組與對照組基因頻率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.073，P>0.05)；漢族與哈族基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.316P>0.05)，見表2。4組患者IL-6 -572C/G基因多態(tài)性基因型中實驗中CC型、GC型、GG型檢出率依次減少，分別為48.87%、34.41%、16.72%，分布符合Hardy-Weinberg平衡；NVAF組與對照組基因頻率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.018，P<0.05)；漢族與哈族基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.008,P>0.05)，見表3。

2.4 多因素分析 將兩組對比差異顯著的危險因素進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示IL-6-572C/G等位基因頻率在NVAF組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明G等位基因是非瓣膜性房顫的危險因子，與CC基因型相比，G等位基因存在能夠增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)。同時高齡、LAD、EF、也與NVAF發(fā)生顯著相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表2 各組患者IL-6 -174G/C基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

表3 各組患者IL-6-572C/G基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

a:P<0.05，與哈族、漢族對照組比較。

表4 NVAF患者危險因素多因素非條件Logistic回歸分析

3 討 論

AF發(fā)病率近幾年不斷增加，其發(fā)生機制探討也相對多元化，在不斷深入研究中，學(xué)者們從遺傳學(xué)角度，以基因多態(tài)性為切入點，開始對AF的發(fā)生機制進一步探討。IL-6由T細胞及巨噬細胞產(chǎn)生，主要功能是誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白如CRP、血清淀粉樣蛋白-A等，IL-6基因定位于第7號染色體短臂2l區(qū)(7p21)內(nèi)。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因啟動子區(qū)域存在基因變異和基因多態(tài)性，這種多態(tài)性與AF的發(fā)生和維持密切相關(guān)[5-8]。同時，基因頻率會因為種族、環(huán)境和地區(qū)不同等位基因的分布頻率亦不同[9-10]。因此，研究基因多態(tài)性與AF的關(guān)系還需進行多種族多民族之間的對照研究。目前國內(nèi)關(guān)于哈族AF基因方面研究報道較少,哈族與漢族人具有不同的遺傳背景及生活習(xí)慣,研究哈族、漢族AF的基因多態(tài)性的特點將有助于探討新疆地區(qū)哈族、漢族人群基因分布情況是否存在差異性。

目前已有研究表明，IL-6-174G/C基因多態(tài)性與NVAF有關(guān)，這種基因多態(tài)性的存在很可能導(dǎo)致IL-6的基因轉(zhuǎn)錄和表達水平在個體間有差異，從而影響IL-6的生物學(xué)水平及其作用，同時指出C等位基因可增強IL-6的轉(zhuǎn)錄[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)，漢族及哈族人群中IL-6-174G/C位點只有GG和GC基因型，未見CC型，且基因型及等位基因在病例組和對照組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)，與國內(nèi)報道相符[11]，故考慮IL-6-174G/C位點的變異與IL-6基因表達及NVAF的發(fā)生、發(fā)展沒有明確的關(guān)系。研究還說明漢族及哈族IL-6-174G/C位點基因分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時，研究還指出漢族及哈族人群中IL-6-174G/C基因多態(tài)性與歐美人種具有不同的頻率分布特征，與日本人群C等位基因頻率為0基本一致[12-13]。

有研究報道，IL-6-572C/G位點G等位基因頻率在AF組分布明顯高于對照組，IL-6-572C/G位點突變的G等位基因可能通過基因調(diào)控促進IL-6的高度表達，使血清IL-6水平升高，使機體處于高炎癥狀態(tài)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，漢族及哈族人群中IL-6-572C/G位點CC型、GC型、GG型檢出率依次為48.87%、34.41%、16.72%，NVAF組與對照組基因頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.018，P<0.05)，Logistic回歸分析示G等位基因存在能夠增加NVAF易感性1.519倍(95%CI:1.087～2.122)，G等位基因是NVAF的危險因子。同時，研究還說明漢族及哈族IL-6-572C/G位點基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。故IL-6-572C/G位點G等位基因可能是新疆地區(qū)漢族及哈族AF發(fā)病的遺傳易感基因。IL-6多態(tài)位點基因分型檢測能在一定程度上預(yù)測AF發(fā)病風險，并可為AF防治提供新途徑。

本研究一般資料對比中發(fā)現(xiàn)，患者高齡(≥75歲)，OR=6.468，95%CI:2.427～17.240(P<0.01)，考慮高齡是發(fā)生AF的危險因素之一，與國內(nèi)外研究基本相符合，高齡的患者所導(dǎo)致NVAF發(fā)生的原因有很多，LAD逐漸擴大，左心耳流速減慢可能是導(dǎo)致NVAF發(fā)生率上升的明顯原因[14-15]。本研究結(jié)果顯示，NVAF組與對照組相比，LAD大于對照組OR=1.053，95%CI:1.022～1.085(P<0.01)，說明了AF誘發(fā)間質(zhì)纖維化、肌原纖維丟失、糖原積聚及細胞連接結(jié)構(gòu)紊亂等亞細胞結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致心房直徑增加。同時，NVAF組EF低于對照組OR=0.946，95%CI:0.922～0.971(P<0.01)。說明EF是防止AF發(fā)生的保護因素，EF越高患者越不易發(fā)生AF。AF時心房肌有效收縮喪失，使舒張期充盈減少及心室收縮功能降低，進一步減少左心室血液充盈及EF。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-6-572C/G位點G等位基因是NVAF遺傳易感性的危險因子，但在漢族及哈族人群中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);IL-6基因-174G/C位點的多態(tài)性與AF的易感性無關(guān)，在漢族及哈族人群中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同時高齡(≥75歲)、LAD是發(fā)生AF的危險因素。EF是防止AF發(fā)生的保護因素，EF越高患者越不易發(fā)生AF。作者通過分析研究數(shù)據(jù)得出比較客觀的結(jié)果，從而為NVAF危險因素及易感性的分子生物學(xué)機制深入研究提供方向。

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Analysis on IL-6-174G/C and -572C/G site gene polymorphism and non-valvular atrial fibrillation population in Xinjiang and national differences*

LiNa,WangShuxia,MuhuYati△

(DepartmentofPhysicalExamination,HealthManagementCenter,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi,Xinjiang830054,China)

Objective To investigate the relationship between IL-6-174C/G and-572C/G site gene polymorphism with non-valvular atrial fibrillation(NVAF) as well as the national differences of interleukin-gene polymorphism between Kazak and Han nationality in Xinjiang region.Methods Seventy-nine Kazak patients of NVAF(Kazak NVAF group),78 Han patients with NVFA (Han NVAF group),75 Han cases of non-AF and 79 Kazak cases of non-AF were selected in Xinjiang region.The venous bloods were collected from extracting DNA.IL-6 gene -174G/C and -572C/G polymorphism in various groups were analyzed by adopting the PCR-RFLP technique.Results The allele frequency of IL-6 -572G/C site G in the NVAF group was significantly higher than that in the control group(χ2=4.076,P<0.05).The allele frequency of IL-6 gene -572 G/C site G had statistical difference between the NVAF group and the control group(OR=1.519，95%CI:1.087-2.122，P<0.05),but the distribution difference between the Han and Kazak control groups had no statistical significance(P>0.05);the advanced age ≥75 years old)(OR=6.468，95%CI:2.427-17.240) and left atrial dimension(OR=1.053，95%CI:1.022-1.085) were the independent factors of AF occurrence;the left ventricular ejection fraction was a protective factor for preventing AF occurrence.The allele frequency of IL-6 gene 174G/C site C and G had no statistical difference among various groups(P>0.05).Conclusion The allele of IL-6-572 G/C site G is a risk factor of genetic predisposition in NVAF.IL-6-174G/C site gene polymorphism has no relation with the susceptibility of AF.

non-valvular atrial fibrillation;gene polymorphism;interleukin 6;national difference

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.004

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260036)；中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)教育分會中國高等教育學(xué)會醫(yī)學(xué)教育專業(yè)委員會醫(yī)學(xué)教育研究項目(2016BQK022)；新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃軟科學(xué)項目(2016D07014)。 作者簡介：李娜(1986-)，住院醫(yī)師， 碩士研究生，主要從事心血管疾病的診治研究?！?/p>

，E-mail：muhuyati@163.com。

R541.75

A

1671-8348(2017)07-0875-04

2016-09-11

2016-11-30)