韓忠耀 李 燕 李方方 陸廷祥 楊樹祥 魏學軍*

1.黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州 都勻 558000；2.河南省上蔡縣人民醫(yī)院，河南 上蔡 463800

RP-HPLC法測定黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量

韓忠耀1李 燕1李方方2陸廷祥1楊樹祥1魏學軍1*

1.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2.河南省上蔡縣人民醫(yī)院，河南 上蔡 463800

目的：采用高效液相色譜法測定黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Agela Promosil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-0.5%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為220nm，分析時間為65 min，對16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷進行了含量測定。結(jié)果：紫丁香苷在0.2881～2.8805μg(r=0.9995)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率(n=6)為100.53%，RSD為1.68%。結(jié)論：該方法簡便、快速、準確，可為大接骨丹根皮藥材的質(zhì)量控制提供參考。

大接骨丹；高效液相色譜法；紫丁香苷；質(zhì)量控制

大接骨丹為山茱萸科鞘柄木屬植物齒裂鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根、葉、花，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》，是貴州少數(shù)民族聚集地、苗醫(yī)院及市(州)級中醫(yī)院應用廣泛的民族藥之一，別名水冬瓜、水五加、接骨丹等，具有活血祛瘀、舒筋接骨的功效，主要用于哮喘、瘀血勞傷、骨折、跌撲損傷等[1]?！吨腥A本草》等記載該藥味苦、辛、微麻，性平，用于風濕關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰痛、慢性腸炎、腹瀉，外用治骨折、跌打損傷等[2-3]。由于該藥臨床療效好，是治療各類骨折、跌打損傷、肌肉勞傷等癥的理想用藥，該藥被《黔南本草》[4]、《貴州民間方藥集》[5]等諸多地方本草收載。目前，國內(nèi)外對大接骨丹藥材的研究主要集中在化學成分相關(guān)研究，如大接骨丹藥材主含苯丙素苷、環(huán)烯醚萜苷、黃酮苷、二萜等化學成分，已確定的單體化合物如紫丁香苷[6]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等[6-11]，同時，現(xiàn)代生物活性實驗研究表明大接骨丹樹皮具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛[12]、免疫抑制[10-11]等作用，而關(guān)于大接骨丹根皮含量測定相關(guān)研究尚未見報道。研究表明，紫丁香苷具有抗炎[13-14]、保肝作用[15-16]等生物活性，這可能與該藥在臨床與民間的廣泛應用有密切關(guān)系，紫丁香苷為該藥的活性成分之一。課題組根據(jù)預實驗的結(jié)果并結(jié)合后期實驗研究的基礎上，首次采用反相高效液相色譜梯度洗脫法建立了黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量測定方法，并對收集到的16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材進行了含量測定，為大接骨丹根皮藥材的質(zhì)量控制及合理開發(fā)利用資源提供參考與依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，在線真空脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱及Chemstaion化學工作站，美國安捷倫科技公司)；BP211型電子分析天平(德國賽多利斯)。

1.2 材料 紫丁香苷對照品(批號：160120，成都克洛瑪生物科技有限公司)，乙腈(色譜純，批號：20160710，天津科密歐化學試劑有限公司)，磷酸(分析純，批號：20140201，重慶川東化工(集團)有限公司)，水為娃哈哈礦泉水(批號：20160504，杭州娃哈哈集團有限公司)，乙醇(分析純，批號：20160401，重慶川東化工(集團)有限公司)，其他試劑均為分析純。

16批大接骨丹根皮藥材均為自采，所有藥材均經(jīng)黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校藥學系中藥教研室王傳明副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根皮。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取紫丁香苷對照品適量，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到紫丁香苷照品儲備液濃度為0.5761mg/mL。

表1 大接骨丹根皮藥材來源

2.1.2 供試品溶液 稱取大接骨丹根皮藥材粉末(過四號篩)約0.5g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇10mL，稱定重量，回流提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件 采用Agela Promosil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，檢測波長為220nm，進樣量為10 μL，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸水(B)梯度洗脫(0～20min，10%～25% A；20～50min，25%～65% A；50～50.1min，65%～10% A；50.1～65min，10% A)，記錄65 min的色譜圖。對照品和大接骨丹根皮藥材樣品的色譜圖見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取紫丁香苷對照儲備液0.5、1、2、3、4、5 mL于10mL量瓶中，分別用甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得。分別注入高效液相色譜儀并測定各成分的色譜峰面積，得到進樣量C(μg)與峰面積A的線性方程。結(jié)果表明，紫丁香苷進樣量在0.2881～2.8805μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為A=69.689C+ 2.1178 (r=0.9995)。

2.3.2 精密度試驗 取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定紫丁香苷峰面積。結(jié)果表明，計算紫丁香苷的RSD值為1.08%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取大接骨丹根皮藥材樣品6份，按照“2.1.2”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣分析，測得紫丁香苷峰面積的RSD值為2.24%，表明該分析方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取大接骨丹根皮(S3)供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、36h進行分析，考察紫丁香苷峰面積，結(jié)果表明，紫丁香苷峰面積的RSD值為2.36%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的大接骨丹根皮(S3)藥材粉末約0.25g，共6份，每組分別精密加入0.5701g/L紫丁香苷對照品溶液1mL，混合均勻，按照“2.1.2”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣分析。結(jié)果表明，紫丁香苷平均加樣回收率(n=6)為100.53%，RSD為1.68%，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2. 4 樣品含量測定 分別按照“2.1.2”項下的方法進行操作，制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣分析，對16批自采大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)藥材進行含量測定，計算紫丁香苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 16批大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化 試驗考察比較了甲醇、70%乙醇、90%乙醇等不同溶劑和超聲、回流、冷浸等方法，其中，以甲醇回流提取1h 提取效果較好。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 預試驗應用二極管陣列檢測器對大接骨丹根皮藥材波長進行檢測，參照3D立體圖構(gòu)向分析，發(fā)現(xiàn)在220nm 處，紫丁香苷色譜吸收相對較大且分離度高，在線梯度洗脫時，基線平穩(wěn)，故確定檢測波長為220nm?？疾炝思状?水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明本實驗采用乙腈-磷酸水具有較高的分離度?？疾炝瞬煌V柱、不同柱溫及不同流速下的分離效果，最終確定了本實驗的色譜分析條件。

3.3 含量測定指標性成分的選擇 含量測定指標性成分的選擇時，通常選擇峰面積較大且保留時間居中的色譜峰作為指標性成分，但是，由于2-8號峰為未知化學成分，根據(jù)文獻[2-6]，課題組利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及對照品比較法嘗試對大接骨丹根皮藥材中的多種化學成分進行指征，但由于該藥物質(zhì)基礎研究相對薄弱，課題組通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及對照品比較法，僅指征了圖譜中1號峰為“紫丁香苷”，并最終確定1號峰紫丁香苷作為本研究含量測定的指標性成分。

含量測定結(jié)果表明，自采的16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量差異較大，說明各批次藥材質(zhì)量存在明顯差異，各產(chǎn)地藥材成分含量差異較大的原因可能是由于大接骨丹藥材的生長環(huán)境、不同采收期、不同生長期等影響因素造成。同時，應加強針對大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)物質(zhì)基礎的深入研究，同時，基于物質(zhì)基礎，開展指紋圖譜的深入研究[17]，對大接骨丹根皮(即水冬瓜根皮)不同部位、不同采收期確定研究以及質(zhì)量標準的提升。

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Determination of Syringin Contents in Root Bark ofToricelliaAngulataOliv.var.Intermedia(Harms) Hu in Guizhou by RP-HPLC

HAN Zhongyao1LI Yan1LI Fangfang1LU Tingxiang1YANG Shuxiang1WEI Xuejun1*

1.Qiannan Medical College for Nationalities,Duyun 558000,China; 2.ShangCai County People’s Hospital， ShangCai 463800,China

Objective To establish an HPLC method for the content determination of syringin in the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu for its quality control.Method Agela Promosil C18(4.6mm×250mm，5μm)column was used and eluted with the mobile phase of acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution in a gradient mode,the flow rate was 1.0mL/min,column temperature was 35 ℃.The detection wavelength was at 220 nm,the analytical time was 65 min. Syringin of 16 batches in the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Huwere detected.Result The linear ranges for syringin was 0.2881～2.8805μg(r=0.9995).Their average recoveries(n=6) were 100.53% and theRSDwas 1.68%,respectively.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and can be used for quality control of the root bark ofToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu.

ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu;HPLC; Syringin；Quality Control

黔南州科學技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)局社會發(fā)展(衛(wèi)生類)科技計劃項目(黔南科合社字(2016)28號)；黔南民族醫(yī)學高等?？茖W?？蒲谢?QNYZ201503)。

韓忠耀(1981-)，男，漢族，碩士，講師，主管藥師，研究方向為中藥、民族藥質(zhì)量控制。E-mail:317230913@qq.com

魏學平(1972-)，男，漢族，教授，研究方向為中藥、民族藥質(zhì)量控制。E-mail:870170786@qq.com

R914

A

1007-8517(2017)04-0030-03

2016-12-16 編輯：梁志慶)